【摘要】：缺血性腦血管病是供應(yīng)大腦血液的血管血流量降低或者完全閉塞所致腦組織變性、壞死而引起的一系列癥狀或體征,具有較高病死率,即使搶救及時(shí)也可能出現(xiàn)癱瘓、失語(yǔ)、癡呆等后遺癥,屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇。天麻(Gastrodia elata Bl.)有“治風(fēng)神藥”之稱,是臨床治療腦缺血/再灌注損傷常用中藥之一。為了進(jìn)一步探究天麻防治功效的分子生物學(xué)機(jī)制,本論文以大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用高通量RNA-Seq測(cè)序分析技術(shù)對(duì)天麻中具有潛在抗腦缺血作用的關(guān)鍵活性成分天麻素進(jìn)行了研究,以期在轉(zhuǎn)錄組水平上探索天麻對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理,為天麻應(yīng)用于臨床腦缺血疾病治療提供理論支持。方法:1.培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞,以連二亞硫酸鈉(Na_2S_2O_4)聯(lián)合無(wú)糖Earle's液構(gòu)建氧糖剝奪再?gòu)?fù)供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R)損傷模型,隨機(jī)分為空白組、模型組、天麻素低、中、高劑量組,采用MTT法測(cè)定各組皮層細(xì)胞存活率,試劑盒測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)漏出率。2.對(duì)空白組、模型組及天麻素預(yù)給藥實(shí)驗(yàn)組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA提取—反轉(zhuǎn)錄—cDNA文庫(kù)構(gòu)建,使用HiSeq X-ten平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,構(gòu)建大鼠皮層細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)功能注釋、差異表達(dá)基因分析、代謝通路富集分析篩選出天麻素對(duì)OGD/R損傷皮層細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的相關(guān)基因與代謝通路。3.采用QRT-PCR技術(shù)對(duì)上一步驟篩選出的部分候選基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證。結(jié)果:1.以8 mM Na_2S_2O_4聯(lián)合無(wú)糖Earle's液進(jìn)行造模,細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪1 h再?gòu)?fù)供2 h存活率為50%~60%,為原代皮層神經(jīng)細(xì)胞OGD/R造模的最適條件。2.OGD/R損傷后大鼠皮層細(xì)胞活性顯著下降,LDH釋放增加,而天麻素預(yù)處理能提高細(xì)胞存活率,并顯著下調(diào)LDH漏出率。3.高通量RNA-seq測(cè)序共獲得260,098,083個(gè)高質(zhì)量堿基序列,76,943,018,898 bp堿基數(shù),Q30堿基百分比在90.32%及以上,各樣品的Reads與參考基因組的比對(duì)效率在81.19%~83.21%之間,比對(duì)效率較高。4.在FDR
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文突起，細(xì)胞呈圓形或橢圓形；培養(yǎng) 3 d 細(xì)胞突起增長(zhǎng)，胞體飽滿，邊緣折光率較高，呈現(xiàn)典型神經(jīng)元形態(tài)特征；培養(yǎng) 5 d 細(xì)胞基本成熟，胞體增大，，立體感較強(qiáng)，相鄰神經(jīng)元突起連接呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；培養(yǎng) 7 d 神經(jīng)元足夠成熟（見(jiàn)圖 1-1），可用于實(shí)驗(yàn)。

圖 1-2 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞 NSE 免疫熒光鑒定神經(jīng)元突起；B：DAPI 染色細(xì)胞核 DNA；C immunofluorescence identification of primary coeuron protruding; B:DAPI stained nucleus DNA; Na2S2O4對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用測(cè)定細(xì)胞線粒體活性，以空白組細(xì)胞存活率胞存活率的影響。由表 1 可知，氧糖剝奪再?gòu)?fù)供一定的損傷作用，隨著 Na2S2O4濃度的增加，細(xì)為 8 mM 時(shí)，細(xì)胞相對(duì)存活率為 56.19±6.29%，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)造模條件選擇 8 mM Na2S2O4。濃度 Na2S2O4對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞活性及存活率的影響（s of different concentrations of Na2S2O4on the activity acortical neurons ( x±s，n=6)
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 楊興旺;張輝;丁智斌;李艷花;尉杰忠;劉春云;趙永飛;張瓊;王青;宋麗娟;柴智;肖保國(guó);馬存根;;紅花黃色素對(duì)糖氧剝奪小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)通路的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2015年07期

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本文編號(hào)：2699796