發(fā)布時間：2020-06-05 12:36

【摘要】：中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床治療疾病的重要手段,其臨床應(yīng)用已有兩千多年的歷史。即使在目前西藥發(fā)展如此迅速的時代,中藥在治療慢性疾病或疾病恢復(fù)調(diào)整中發(fā)揮著非常重要的作用。代謝組學(xué)旨在通過分析代謝產(chǎn)物中的小分子化合物,反向追蹤已發(fā)生的病變和代謝通路來研究藥物的作用機制。應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)探討中藥的作用機制為中藥復(fù)方及其配伍研究提供一種新思路。中藥復(fù)方金鈴子散由川楝子和延胡索按1:1配伍而成,首見于金元四大家之一“寒涼派”代表劉完素的《素問·病機氣宜保集》,是治療肝郁化火而致的各種痛癥的代表方劑。目前金鈴子散主要用于治療胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎、慢性肝炎、膽囊炎等疾病。國內(nèi)對金鈴子散的研究主要為藥物配比、炮制方法、藥理學(xué)研究,而其相關(guān)作用機理研究尚不明確。為了探索金鈴子散及其拆方在治療疾病中的作用機制和代謝路徑,本研究建立醋酸扭體、熱板、角叉菜膠致足腫脹模型,結(jié)合氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)及液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)技術(shù),尋找相關(guān)差異性代謝物,構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)圖,從代謝水平上揭示金鈴子散抗炎鎮(zhèn)痛機理。一、金鈴子散質(zhì)量標準研究為保證金鈴子散的質(zhì)量可控,對金鈴子散中兩味中藥的主要有效成分進行含量測定,為后續(xù)金鈴子散抗炎鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。本研究以川楝素和延胡索乙素為標準品,對2015版《中國藥典》中記載的川楝子和延胡索含量測定方法進行了改進,并進行了含量測定和方法驗證。結(jié)果顯示川楝子和延胡索中有效成分含量均符合藥典的相關(guān)要求。二、延胡索鎮(zhèn)痛作用機制的代謝組學(xué)研究為探索延胡索治療痛癥的作用機制,本研究采用醋酸扭體法動物模型,觀察小鼠扭體抑制率來評價其鎮(zhèn)痛活性。通過GC/MS對小鼠血清進行分析,將GC/MS采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到XCMS中得到相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣,為將數(shù)據(jù)可視化,將其導(dǎo)入到SIMCA-P或Met PA中進行PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析。結(jié)果顯示:空白對照組與模型組生物代謝物輪廓變化明顯,共篩選出甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、檸檬酸等18種差異性代謝物。將相關(guān)差異性代謝物導(dǎo)入到Met PA中進行通路富集,得到延胡索干預(yù)痛癥的相關(guān)代謝通路,其中影響較大的有甘油脂代謝,乙醛酸和二羧酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,亞油酸代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成。鎮(zhèn)痛作用機制主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周致痛物質(zhì)分泌有關(guān)。三、川楝子鎮(zhèn)痛作用機制的代謝組學(xué)研究為探索川楝子對痛癥影響的作用機制,本實驗采用化學(xué)刺激痛(醋酸扭體法)小鼠模型,觀察其鎮(zhèn)痛效果。藥理學(xué)結(jié)果表明,川楝子對小鼠扭體抑制率有較好的效果。小鼠血清的GC/MS代謝組學(xué)分析,共篩選出丙氨酸、絲氨酸、蘋果酸等13個差異性代謝物。相關(guān)度較高的代謝通路為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甘油脂代謝,乙醛酸和二羧酸代謝以及轉(zhuǎn)運RNA-酰胺酰類生物合成。其作用機制主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)途徑有關(guān)。四、金鈴子散及其拆方鎮(zhèn)痛作用的代謝組學(xué)研究為進一步比較金鈴子散及其拆方鎮(zhèn)痛作用機制的異同,本實驗采用熱板法和醋酸扭體法動物模型,觀察小鼠痛閾提高率和扭體抑制率,比較復(fù)方中藥及其單味藥鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果顯示:復(fù)方中藥鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單方。采用GC/MS技術(shù)測定小鼠血清共篩選出甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等14個與痛癥相關(guān)的差異性代謝物。通過Met PA進行代謝通路富集,發(fā)現(xiàn)代謝通路甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與痛癥相關(guān)度較高。代謝網(wǎng)絡(luò)圖顯示,金鈴子散復(fù)方鎮(zhèn)痛的作用機制主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周致痛物質(zhì)的分泌有關(guān)。五、金鈴子散及其拆方抗炎作用的代謝組學(xué)研究為探索金鈴子散及其拆方對炎癥大鼠模型體內(nèi)代謝物變化的影響,本研究采用角叉菜膠致大鼠足腫脹模型,觀察造模后各組大鼠足腫脹情況,檢測大鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素1β(IL-1β)含量。結(jié)果顯示:模型組較空白對照組足腫脹程度明顯提高(p0.05),IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明顯提高(p0.05)。將收集到的血清采用GC/MS技術(shù)分析,尿液采用HPLC/MS分析,從血清和尿液中一共篩選出谷氨酰胺、丙氨酸、琥珀酸等28種與炎癥相關(guān)的差異性代謝物。將相關(guān)的差異性代謝物進行網(wǎng)絡(luò)富集,得到β-丙氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝等與炎癥相關(guān)度較高的代謝通路。將這些代謝通路繪制成網(wǎng)路圖對其抗炎作用機制進行解釋。金鈴子散抗炎作用機制主要為免疫調(diào)節(jié),抑制白細胞趨化、移動和活化,其中影響較大的為細胞因子途徑和核轉(zhuǎn)錄因子-κB途徑。
【圖文】：

12e圖 2-1 延胡索含量測定的色譜圖;（a）延胡索對照品、（b）延胡索醇提液、（c）金鈴子散醇提液、（d）延胡索水提液、（e）金鈴子散水提液Fig.2-1 Chromatogram of Corydalis Yanhusuo content determination; (a) Corydalis Yanhusuostandard product map、(b) Corydalis Yanhusuo alcohol extract、(c) Jinlingzisan alcohol extract、(d) Corydalis Yanhusuo water extract、(e) Jinlingzisan water extract2.6.2 方法學(xué)考察結(jié)果2.6.2.1 線性關(guān)系考察對照品濃度與峰面積的線性回歸方程為 y=16.928x-38.155（R2=0.9983），線性范圍為 26.8～64.0 μg·ml-1。

13圖 2-2 延胡索乙素標準曲線圖Fig. 2-2 Tetrahydropalmatine standard curve 精密度試驗鈴子散醇提液連續(xù)進樣 6 針后，，色譜峰面積的 RSD（n=6）為 0.3表 2-4 精密度試驗結(jié)果Table 2-4 Date of instrument precision testNo. 峰面積（mAU*s）1 829.92 822.13 829.6
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2698065