【摘要】：心肌肥大(cardiac hypertrophy)的一個主要特征是心肌細胞體積增大,直徑增寬,及肌節(jié)數(shù)量增多,而細胞數(shù)目保持不變。盡管早期對心功能具有一定的代償作用,但長期的心肌肥大會引起心肌耗氧量增加,導致心絞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率明顯增高,嚴重影響心血管疾病患者的預后,因而逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展已成為防治心血管疾病的重要舉措。在哺乳動物早期胚胎中,心肌細胞分裂活躍,以適應心臟快速增長的需要。但出生后不久,周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)表達量均迅速降低,而CDK抑制因子(CDK inhibitor,CDKI)則快速增加,促使心肌細胞退出細胞周期,成為一種高度分化的終末細胞。然而,大量的研究發(fā)現(xiàn),在病理刺激下,成熟的心肌細胞能重返細胞周期,細胞周期調(diào)節(jié)因子再度激活表達,共同促進DNA和蛋白質(zhì)合成,但卻無法順利完成有絲分裂,表現(xiàn)為心肌細胞肥大。細胞周期是在細胞周期正調(diào)控因子(cyclin-CDK復合物)和負調(diào)控因子(CDKI)共同調(diào)節(jié)下完成的。研究心肌肥大過程中細胞周期調(diào)節(jié)因子的動態(tài)變化,對于深入了解心肌肥大的發(fā)生發(fā)展機制,以及尋找新的防治靶點具有重要價值。雷公藤甲素(triptolide,TP)來源于雷公藤屬植物,具有調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)因子表達的作用。然而,TP對心肌細胞周期調(diào)節(jié)因子的影響如何尚不明確。本課題旨在研究在心肌肥大過程中細胞周期調(diào)節(jié)因子的時相性表達變化及TP對其表達的影響,探討通過調(diào)節(jié)細胞周期防治心肌肥大的可行性。方法:1.血管緊張素(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)1.0μmol·L~(-1)分別處理H9c2細胞5、10、30min,和1、2、3、6、12、24、48h,羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色并檢測細胞面積;real-time PCR法檢測細胞周期蛋白B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,以及CDK抑制因子p21 mRNA的表達變化情況。2.分離培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVM),Ang II分別處理5、10、30min和1、2、3、6、12、24h,采用流式細胞術檢測細胞周期的變化。3.同上方法采用Ang Ⅱ處理NRVM,分別加入雷公藤甲素(triptolide,TP)1.0μg·L~(-1)孵育不同時間。鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞面積;real-time PCR法檢測β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)mRNA和細胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA的表達情況;Western blot法檢測蛋白表達情況。4.動物模型建立及藥物干預:健康清潔級雄性C57小鼠72只,隨機分為異丙腎上腺素組(isoprenaline,ISO)和TP治療組,各6個時相點,共12組(n=6)。ISO(10mg·kg~(-1),sc,bid)制備心肌肥大模型,TP(10μg·kg~(-1)·d~(-1),ip,qd)分別處理0、1、3、7、14、21d。5.密切觀察小鼠生活狀況及死亡情況。末次給藥后,稱量體重(BW)和心重(HW),測量小鼠脛骨長度(TL),以HW/TL作為心臟指數(shù)。分別采用HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況;麥胚凝集素染色觀察計算細胞平均面積。6.采用real-time PCR法檢測β-MHC及細胞周期因子cyclin A2、B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,p21、p27 mRNA的表達變化情況;Western blot法檢測β-MHC、cyclin D1、CDK4、CDK6、P21蛋白表達情況。結(jié)果:1.隨著Ang Ⅱ刺激時間的延長,H9c2細胞面積逐漸增大;細胞周期調(diào)節(jié)因子均于刺激后出現(xiàn)短暫反應性表達增加,cyclin E1與CDK2、CDK4 mRNA在5min時達到峰值,cyclin D1 mRNA在10min時達到峰值,隨后一直呈減少趨勢;CDK6與cyclin B1mRNA表達出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象,分別于5和30min達第一峰,隨后表達減少,于2h達最低點,接著又表達增加,于12h達第二峰。p21 mRNA表達量于30min達峰值,隨后逐步減少,3h時表達最低,之后又緩慢增加。2.與H9c2細胞相比,隨著刺激時間的延長,NRVM細胞肥大反應更為明顯,6h后細胞面積增加呈加速趨勢。與對照組相比,經(jīng)TP處理后,細胞面積升高趨勢明顯減弱。流式細胞術檢測細胞周期結(jié)果顯示,在Ang Ⅱ刺激下,NRVM細胞G1期細胞數(shù)減少,S+G2期的細胞數(shù)明顯增加。3.Ang Ⅱ處理5min時,NRVM細胞β-MHC、cyclin A1、p21、p27 mRNA出現(xiàn)反應性小幅度表達增加;p21 mRNA于30min達極大值。β-MHC mRNA于刺激6h表達最低,隨后其表達量隨刺激時間增加而驟升,于48h達最大值,這與細胞面積肥大結(jié)果相一致。此外,CDK1、2、4、6、cyclin B1、D1、p21 mRNA均于2h表達最低,cyclin A1和p27 mRNA表達量在1h時達最低位,cyclin E1 mRNA于3h時表達最低;之后隨著刺激時間的延長,細胞周期因子表達均出現(xiàn)回升,cyclin A1 mRNA于3h表達達峰值;然而在Ang Ⅱ刺激24~48h,僅CDK1、p21、p27 mRNA表達升高較顯著(P0.01),其它的周期正調(diào)控因子雖有緩慢增加,但均維持在較低水平;而TP在減小細胞面積的同時能夠糾正細胞周期因子mRNA的異常表達。4.蛋白檢測結(jié)果顯示,隨著Ang Ⅱ處理時間增加,β-MHC、CDK4、CDK6蛋白表達逐漸減少;而P21于刺激30min短暫升高后又迅速降低,CDK4、P21均于2h達最低值,CDK6與β-MHC均于30min達最低位,而后隨刺激時間的增加而遞增;在Ang Ⅱ刺激12~24h,所以蛋白表達均達到最大值。在細胞肥大過程中,就細胞周期因子在mRNA和蛋白水平上表達變化而言,Ang Ⅱ?qū)Φ鞍妆磉_的影響較mRNA更明顯;而TP可明顯糾正上述細胞周期因子蛋白表達異常。5.ISO處理組小鼠皮毛暗淡無光澤,呼吸急促,活動較少,反應遲鈍,隨著ISO作用時間增加,上述反應越明顯;與模型組相比,TP組小鼠活動與進食情況明顯改善。6.ISO處理3d后,小鼠HW/TL比值開始顯著升高,細胞面積增大,并隨著時間的延長而持續(xù)增加,同時出現(xiàn)心肌纖維斷裂、炎細胞浸潤和膠原沉積。TP能明顯降低心臟指數(shù),改善心肌組織損傷,減輕纖維化。7.在ISO誘導小鼠心肌肥大過程中,β-MHC、cyclin D1、E1、CDK2、4、6 mRNA表達逐漸減少,其中β-MHC、cyclin D1、CDK6 mRNA于1d時達最低值,cyclin E1、CDK2、4 mRNA于3d時達谷值,隨后表達量均又逐漸升高;β-MHC mRNA于14d達峰值后表達略微降低。而ISO誘導小鼠1d即誘導cyclin A2、B1、CDK1 mRNA表達驟升,且cyclin B1 mRNA持續(xù)增高至3d達峰值,而其他所有周期因子均于7d時達峰值,隨后一直呈減少趨勢;在21d時,cyclin B1、E1 mRNA表達較正常對照組顯著降低(P0.01)。p21和p27 mRNA表達量隨ISO作用時間延長呈遞增和遞減趨勢,p27 mRNA于3d時表達最低;p21、p27 mRNA均于14d達峰值,在21d時表達量雖有所降低,但仍然高于正常對照組。然而TP在減小心臟大小及改善心臟功能的同時,可顯著糾正胚胎基因β-MHC及細胞周期調(diào)控因子cyclin、CDK、CKI mRNA的異常表達。8.蛋白檢測結(jié)果顯示,隨著ISO作用時間的延長,β-MHC蛋白表達逐漸增高,于14d達峰值后表達量又減少。在ISO處理3d后cyclin D1、CDK6蛋白表達達峰值,隨后一直呈減少趨勢。CDK4、P21蛋白表達量均于3d達最低值,之后又快速升高。而TP可顯著糾正上述周期因子蛋白異常表達。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)心肌細胞株H9c2和NRVM細胞肥大反應,以及小鼠心肌肥大過程中均伴隨著細胞周期調(diào)節(jié)因子的表達失衡。2.雷公藤甲素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞H9c2和NRVM肥大反應,有效減輕異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥大和心肌纖維化。3.雷公藤甲素抗心肌肥大機制可能與其糾正細胞周期調(diào)節(jié)因子平衡失調(diào)有關。
【圖文】：

圖 1. Ang II 處理后 H9c2 細胞面積變化情況羅丹明標記鬼筆環(huán)肽染色（bar=50 μm）；B. 細胞面積變化 ( x SEM，n＝與正常對照組 (0min) 比較，，*P<0.05，**P<0.01 AngⅡ誘導 H9c2 心肌細胞周期蛋白基因的時相性表達 II 刺激 H9c2 細胞 cyclin B1 mRNA 的時相性表達呈現(xiàn)明顯的“波峰始逐漸增加至 30min 達第一個“波峰”，此時表達量達對照組的 量逐漸降低，于 2h 時表達最低，出現(xiàn)第一個“波谷”。之后隨著長，cyclin B1 mRNA 表達再次升高，于 6h 達第二次峰值后其表達 48h 其表達量基本恢復到正常水平（圖 2A）。Ang II 處理 H9c2 細胞A 表達量先是緩慢增加至 10min 達最高點，較對照組增加了 15%；h 達最低位，此時表達量較正常對照組降低了 40%；之后又緩慢回至正常水平；但 48h 時，與對照組相比，其表達量再次降低 27%（

圖 2. Ang II 對 H9c2 心肌細胞周期蛋白 mRNA 表達的影響 ( x SEM，n=6)A. cyclin B1 mRNA；B. cyclin D1 mRNA；C. cyclin E1 mRNA與正常對照組 (0min) 比較，*P<0.05，**P<0.012.2.3 AngⅡ誘導 H9c2 心肌細胞周期蛋白依賴性激酶基因的時相性表達Ang II 刺激 H9c2 細胞 5min 即誘導 CDK2 mRNA 表達明顯增加，較對照組增加了1.38 倍。從 10min 開始，CDK1、2、4、6 的 mRNA 表達開始下降，其中 CDK1 mRNA在 3h 表達量降至最低位，僅為對照組的 76%，之后又迅速增高，于 24~48h 達正常對照組的 1.3 倍。隨著時相點的延長，CDK2 和 CDK4 mRNA 表達呈現(xiàn)“階梯式”下降，二者均于 3h 時達最低點，較正常對照組分別降低了 24%和 57%，而后雖有小幅度回升，但總體維持于較低水平。CDK6 mRNA 表達量在 Ang II 刺激 5min 達第一峰后逐漸降低，于 2h 時達“波谷”，較對照組降低了 50%；隨后表達量又迅速升高至 12h達第二峰，之后又呈現(xiàn)下降趨勢（圖 3）。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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1 童洋飛;郭奉潔;潘夕春;陳波;陳曉紅;張海港;;雷公藤甲素對大鼠心肌H9c2細胞肥大的抑制作用[J];中國藥房;2015年07期

本文編號：2694760