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真武湯含藥血清對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

發(fā)布時(shí)間：2020-06-03 11:25

【摘要】：目的:通過(guò)采用血清藥理學(xué)方法,從不同角度觀察經(jīng)方真武湯含藥血清對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,探討真武湯對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷及凋亡的保護(hù)作用機(jī)制。為臨床應(yīng)用真武湯治療心力衰竭提供科學(xué)的理論依據(jù)。材料與方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用新生1-3天齡的健康Wistar大鼠(雌雄不拘)20只,作為心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)用。另外取3個(gè)月齡健康雄性Wistar大鼠10只(250-270 g),制作含藥血清。實(shí)驗(yàn)藥品包括經(jīng)方真武湯,其五味中藥組成分別是茯苓、白術(shù)、白芍、附子、生姜。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中草藥局提供,由制劑室制備,進(jìn)行煎煮后,按人和動(dòng)物的等效劑量換算方法,換算出大鼠服用劑量,其劑量組相當(dāng)生藥量18.9g/(kg·d)。卡托普利的每片劑量為12.5毫克。首先制備真武湯含藥血清及卡托普利含藥血清。制備真武湯含藥血清的制備方法:取正常Wistar大鼠灌服真武湯和卡托普利,計(jì)量、方法和參考文獻(xiàn)等同體內(nèi)試驗(yàn)部分。本實(shí)驗(yàn)中大鼠給藥劑量的計(jì)算方法是:按照人與大鼠體表面積進(jìn)行計(jì)算得到的,按照其等效劑量系數(shù)的折算方法,計(jì)算出大鼠的給藥劑量,計(jì)算公式具體是:大鼠的給藥物劑量(mg/kg)=成人的服藥劑量(mg/d)/60kg× 7),給大鼠灌胃,連續(xù)7天。在末次灌胃1小時(shí)后從腹腔靜脈取血,無(wú)菌條件下分離血清、加熱滅活備用(根據(jù)國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“中藥復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)研究”課題組建議的方法)。然后進(jìn)行心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng):用75%的酒精消毒,在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下打開(kāi)胸腔,剪取心室部分放于盛有預(yù)冷PBS的平皿中。用吹打管吹打去除殘血,移入另一平皿中,加入適量0.06%胰酶(等量0.125%胰酶和0.1%膠原酶II)。將心室肌剪成1mm3大小的碎塊,移入50ml錐形瓶,37℃消化,每隔1min磁力攪拌器攪拌。消化1Omin,棄去首次消化上清液,加入適量0.06%胰酶,繼續(xù)消化8min,如此反復(fù)5次,分別收集每次消化的上清液,并加入等量10%FBS培養(yǎng)液終止消化。1500r離心8min,棄上清液,加入適量培養(yǎng)液,進(jìn)行吹打,制成了細(xì)胞懸液,在37℃條件培養(yǎng)皿中置于5%CO2培養(yǎng)箱里進(jìn)行靜置培養(yǎng)。根據(jù)成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞貼壁時(shí)間的不相同,采用差數(shù)貼壁1.5h。48h后換液,并加入200v 5-brdu 0.1mmol/L,以抑制成纖維細(xì)胞的增殖,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期良好和生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組情況:共分為四組,包括空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、卡托普利組和真武湯組。空白對(duì)照組:換液為含10%空白大鼠血清的DMEM的培養(yǎng)基,進(jìn)入下一步的繼續(xù)培養(yǎng),繼續(xù)經(jīng)過(guò)48h培養(yǎng)。模型對(duì)照組:換液為含10%空白大鼠血清+濃度為1Oμmol/L異丙腎上腺素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h�？ㄍ衅绽M:換液為含10%空白大鼠血清+濃度為1Oμmol/L異丙腎上腺素的DMEM培養(yǎng)基+濃度為μmol/L卡托普利的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。真武湯組:換液為含濃度為濃度為1Oμmol/L異丙腎上腺素加10%真武湯含藥血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。本實(shí)驗(yàn)研究是在課題前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)研究基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)入體外實(shí)驗(yàn)研究部分。首先通過(guò)細(xì)胞的提取與培養(yǎng),異丙腎上腺素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn),免疫熒光檢測(cè)線粒體膜電位,MTT法測(cè)定吸光值,研究真武湯含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞生存和線粒體膜電位的影響,闡述真武湯含藥血清對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。為進(jìn)一步進(jìn)行真武湯含藥血清抗心肌細(xì)胞凋亡以及其抗凋亡機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的不同方法從不同側(cè)面,從形態(tài)學(xué)和定量檢測(cè)方面闡述真武湯含藥血清抗凋亡作用,分別是免疫熒光檢測(cè)線粒體膜電位(△ Ψ)用羅丹明123(rhodamine 123)對(duì)線粒體進(jìn)行染色,檢測(cè)線粒體膜電位的情況;AO/EB雙重?zé)晒馊旧珯z測(cè)細(xì)胞凋亡;TUNEL分析,測(cè)定心肌培養(yǎng)細(xì)胞的MDA含量,計(jì)算凋亡細(xì)胞的數(shù)量;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率;Western-blot法測(cè)定培養(yǎng)心肌細(xì)胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3、Sirt-1等相關(guān)蛋白表達(dá),從蛋白表達(dá)方面研究真武湯含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制,為臨床抗心力衰竭治療提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料采用x 2檢驗(yàn);計(jì)量資料的分析是以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,多組間的分析采用的是單因素方差分析的方法,兩組間的比較用q檢驗(yàn),以a=0.05,P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.異丙腎上腺素對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,異丙腎上腺素10 μ mol/L作用于心肌細(xì)胞6h后,可明顯降低細(xì)胞存活率。真武湯含藥血清濃度的篩選過(guò)程中各組心肌細(xì)胞與相應(yīng)干預(yù)措施作用48h后,異丙腎上腺素組、異丙腎上腺素+40%含藥血清組、異丙腎上腺素+20%含藥血清組、異丙腎上腺素+10%含藥血清組及異丙腎上腺素+5%含藥血清組細(xì)胞活性均低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);異丙腎上腺素+卡托普利組、異丙腎上腺素+40%含藥血清組、異丙腎上腺素+20%含藥血清組、異丙腎上腺素+10%含藥血清組及異丙腎上腺素+5%含藥血清組細(xì)胞活性均高于異丙腎上腺素組(P0.05);異丙腎上腺素+20%含藥血清組、異丙腎上腺素+10%含藥血清組與異丙腎上腺素+卡托普利組相比細(xì)胞存活率相似,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度的真武湯含藥血清作用于細(xì)胞,隨著含藥血清濃度升高對(duì)細(xì)胞存活率有增加作用,但同時(shí)我們考慮到含藥血清的濃度越高可能對(duì)細(xì)胞毒性作用越大,而10%含藥血清組與卡托普利對(duì)細(xì)胞活性影響相似的,這就為我們選定10%含藥血清作為最佳濃度提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.免疫熒光檢測(cè)線粒體膜電位(△Ψ):模型組與正常組比較心肌細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)明顯變化,線粒體熒光表達(dá)明顯增強(qiáng),而真武湯、西藥組與模型組比較明顯改善,線粒體熒光表達(dá)有所減弱。3.AO/EB雙重?zé)晒馊旧珯z測(cè)細(xì)胞凋亡:空白對(duì)照組可見(jiàn)大部分細(xì)胞的核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,胞膜完整,著色均勻;模型對(duì)照組可見(jiàn)大量壞死細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞,胞膜破損、核膜完整,染色質(zhì)染均勻的紅色橘紅色呈致密斑塊或碎片狀;真武湯組核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,胞膜完整,同時(shí)存在較多核染亮綠色呈致密斑塊或碎片狀的早期凋亡細(xì)胞和散在的晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞;卡托普利組可見(jiàn)大量核染亮綠色呈致密斑塊或碎片狀的早期凋亡細(xì)胞和核染橘紅色呈致密斑塊或碎片狀的晚期凋亡細(xì)胞。TUNEL分析和流式細(xì)胞儀檢測(cè)計(jì)算后異丙腎上腺素組凋亡率明顯增加,而異丙腎上腺素+卡托普利組和異丙腎上腺素+含藥血清組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于異丙腎上腺素組。4.TUNEL分析:MDA的量�？煞从臣�(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組MDA含量較空白組MDA含量顯著增加,有顯著差異(P0.05),加入真武湯后心肌細(xì)胞MDA含量與模型組相比,明顯減少(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯升高,與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P0.01);卡托普利組、真武湯組與模型對(duì)照組相比凋亡率明顯降低,有顯著差異(P0.05),真武湯組與卡托普利組相比較沒(méi)有明顯差異(P0.05)。5.Western blotting檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Sirt-1蛋白的表達(dá)情況:模型對(duì)照組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低、Bax蛋白表達(dá)增加、Bcl-2/Bax比值明顯降低,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01);真武湯組和卡托普利組與模型對(duì)照組相比較,Bcl-2蛋白表達(dá)增加、Bax蛋白表達(dá)降低(P0.05);模型對(duì)照組心肌細(xì)胞Caspase-3明顯降低,與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01);真武湯組和卡托普利組與模型對(duì)照組相比較,Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P0.05);真武湯組和卡托普利組與模型對(duì)照組相比較,Sirt-1蛋白表達(dá)增加(P0.05)。結(jié)論:1.真武湯含藥血清能夠明顯改善氧化損傷大鼠心肌細(xì)胞線粒體的膜電位;2.真武湯含藥血清能夠明顯降低氧化損傷大鼠心肌細(xì)胞MDA含量;3.真武湯含藥血清能夠明顯抑制氧化損傷大鼠心肌細(xì)胞的凋亡;4.真武湯含藥血清能夠明顯降低氧化損傷大鼠心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá),提氋Bcl-2蛋白表達(dá);5.真武湯含藥血清能夠明顯降低氧化損傷大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá),提高Sirt-1蛋白表達(dá)。
【圖文】：

形態(tài)圖,形態(tài)