【摘要】：三七總皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)是從傳統(tǒng)中藥三七(Panax noto ginseng(Burk)F.H.Chen)塊根中提取的一種有效成分,是三七的主要有效成分,因具有良好的活血化瘀作用而廣泛應(yīng)用于腦缺血疾病的臨床治療。研究發(fā)現(xiàn),三七總皂苷能夠發(fā)揮缺血后腦保護(hù)作用,并改善缺血后腦內(nèi)血液循環(huán)狀況。對(duì)三七總皂苷改善腦血液循環(huán)的機(jī)制已經(jīng)有許多研究,然而,其上游的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。本課題組通過(guò)前期基因芯片檢測(cè),發(fā)現(xiàn)擬缺血損傷后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain MicrovascμLar E ndothelial Cells,BMECs)的胞漿型磷脂酶 A2IVA(phospholipaseA2groupIVA,PLA2G 4A)mRNA顯著過(guò)表達(dá),而三七總皂苷則可以抑制擬缺血損傷后BMECs中PLA2G4A mRNA的過(guò)表達(dá)。PLA2G4A是一種廣泛存在于機(jī)體中的代謝調(diào)節(jié)酶,其可特異性分解細(xì)胞膜磷脂合成花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),AA又是多種活性產(chǎn)物的上游源頭,這些活性產(chǎn)物合成后會(huì)參與血管內(nèi)凝血、血管收縮功能等多種生理及病理進(jìn)程,在腦缺血后損傷發(fā)揮重要作用。因此我們推測(cè)PLA2G4A mRNA的過(guò)表達(dá)與腦缺血后腦病理過(guò)程有關(guān)聯(lián)性,而抑制PLA2G4A mRNA過(guò)表達(dá),則可能是三七總皂苷發(fā)揮腦保護(hù)及改善腦血流作用的機(jī)制之一。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)觀察三七總皂苷對(duì)擬缺血損傷內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4A mRNA及其下游產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用,以期深入探索三七總皂苷發(fā)揮腦保護(hù)及改善腦血流作用的上游分子機(jī)制。目的:探究三七總皂苷對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的PLA2G4A mRNA和蛋白以及其下游產(chǎn)物的調(diào)控作用,探索三七總皂苷發(fā)揮腦保護(hù)及改善腦血流作用的上游機(jī)制,為三七總皂苷發(fā)揮腦保護(hù)及改善腦血流作用提供依據(jù),探尋腦缺血疾病防治新的靶點(diǎn)。方法:1.將從SD大鼠幼鼠腦部分離的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),經(jīng)過(guò)純化和兩次傳代,得到第三代的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)將第三代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象給予氧糖剝奪(Oxygen-Glucose-Deprivation,OGD)干預(yù)的造模,建立腦血管內(nèi)皮細(xì)胞血氧缺乏模型。2.實(shí)驗(yàn)觀察OGD造模后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4A mRNA和蛋白的表達(dá):將第三代內(nèi)皮細(xì)胞分為PNS組、OGD模型組、空白組三組分別進(jìn)行處理后,采用RT-PCR和Western Blotting法分別檢測(cè)PNS組、OGD模型組、空白組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的PL A2G4A mRNA和蛋白的表達(dá)水平。3.PLA2G4A抑制劑濃度篩選,Pyrrophenone是PLA2G4A特異抑制劑,可抑制其合成花生四烯酸的功能。以第三代大鼠腦微血管細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,設(shè)置若干抑制劑濃度梯度,并OGD造模,后用ELISA法檢測(cè)Pyrrophenone對(duì)OGD造模后的內(nèi)皮細(xì)胞AA生成量的影響,并計(jì)算出Pyrrophenone對(duì)花生四烯酸的半抑制濃度(IC50)作為實(shí)驗(yàn)濃度。4.觀察三七總皂苷對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PLA2G4A下游產(chǎn)物花生四烯酸的調(diào)控作用:將第三代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為正常組、OGD模型組、三七總皂苷組及Pyrrophenone組共四組。分別給予相應(yīng)處理后,使用ELISA法檢測(cè)各組花生四烯酸的合成量。5.觀察三七總皂苷對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中20-HETE、TXA2/PGI2的影響:將三代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為四組:正常組、OGD模型組、三七總皂苷組及抑制劑組。分別給予相應(yīng)處理后,采用ELISA法檢測(cè)并計(jì)算各組細(xì)胞中TXA2/PGI2,20-HETE的情況。結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)觀察到,PLA2G4A在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。2.OGD造模可誘發(fā)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的PLA2G4AmRNA和蛋白過(guò)表達(dá):與正常組比較,OGD組的PLA2G4AmRNA和蛋白水平顯著增加。3.三七總皂苷明顯抑制OGD誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4AmRNA和蛋白表達(dá):通過(guò)RT-PCR和Western Blotting結(jié)果可知,與模型組相比,三七總皂苷組經(jīng)OGD造模后PLA2G4AmRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001。4.三七總皂苷抑制OGD誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4A產(chǎn)物花生四烯酸的過(guò)表達(dá),通過(guò)Elisa法可以得知,與模型組相比較,三七總皂苷下調(diào)OGD誘導(dǎo)的花生四烯酸表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5.三七總皂苷和Pyrrophenone可下調(diào)擬缺血損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的TXA2/PGI2比例及20-HETE表達(dá)量。ELISA結(jié)果顯示:與正常組相比,OGD模型組的TXA2/PGI2比例升高,20-HETE表達(dá)量明顯過(guò)表達(dá);與OGD組比較,三七總皂苷組和Pyrrophenone組細(xì)胞的TXA2、PGI2、20-HETE表達(dá)量顯著下降(P0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)觀察到PLA2G4A在大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),擬缺血損傷后PLA2G4A mRNA和蛋白水平均明顯上升,而三七總皂苷則可以抑制造模帶來(lái)的PLA2G4AmRNA和蛋白水平的上升。2.三七總皂苷可有效下調(diào)造模后內(nèi)皮細(xì)胞的前炎癥因子AA及其其下游TXA2、PGI2、20-HETE的過(guò)表達(dá),這可能與三七總皂苷抑制PLA2G4AmRNA和蛋白生成相關(guān),PLA2G4A蛋白的過(guò)表達(dá)則可能是誘發(fā)AA及其下游產(chǎn)物過(guò)表達(dá)的原因。抑制PLA2G4A mRNA及蛋白的表達(dá),以下調(diào)AA表達(dá)量及其下游產(chǎn)物表達(dá)量,可能是三七總皂苷在缺血性腦損傷中發(fā)揮改善腦血流作用的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2693109