發(fā)布時間：2020-05-31 05:26

【摘要】：目的:研究華蟾毒精(Cinobufagin,CINO)對人肝癌細胞的抑制作用及其分子機制。方法:體外培養(yǎng)人肝癌細胞SK-Hep1,經(jīng)CINO處理后,(1)通過CCK8、細胞克隆形成實驗檢測細胞的增殖情況;(2)并用流式細胞術(shù)分析CINO處理后SK-Hep1細胞的周期變化;(3)此外,經(jīng)CINO處理后,運用蛋白免疫印跡實驗(Western blot)分析周期相關(guān)蛋白(Cyclin d1、P27)、凋亡標志蛋白[剪切的PARP(c-PARP)、剪切的Caspase3(c-Caspase3)]、AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白(p-AKT、p-P70S6k、p-S6)、DNA損傷標志蛋白γH2AX的表達情況、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中eIF2α通路相關(guān)蛋白(p-eIF2α、ATF4)、以及用PCR從mRNA水平分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物XBP1的活化剪切情況;(4)進一步地,通過轉(zhuǎn)染eIF2α-S51A質(zhì)粒、si-eIF2αRNA后與CINO聯(lián)用,經(jīng)Western blot分析c-PARP及eIF2α通路相關(guān)蛋白的表達;(5)另外,用AKT/mTOR抑制劑LY294002或轉(zhuǎn)染AKT活化質(zhì)粒后,再經(jīng)CINO刺激,通過Western blot分析c-PARP及AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:(1)CINO抑制人肝癌細胞SK-Hep1的增殖:CCK8、細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示,SK-Hep1細胞經(jīng)CINO處理后,其增殖能力明顯降低。(2)CINO阻滯人肝癌細胞SK-Hep1的細胞周期:CINO處理后,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細胞周期阻滯在G0/G1期。(3)CINO通過下調(diào)人肝癌細胞SK-Hep1 Cyclin d1和上調(diào)P27蛋白表達影響細胞周期:Western Blot實驗檢測細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin d1、P27表達發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CINO處理后下調(diào)了Cyclin d1蛋白表達水平,上調(diào)了P27蛋白表達水平。(4)CINO誘導(dǎo)人肝癌細胞SK-Hep1凋亡:Western Blot實驗檢測凋亡標志蛋白c-PARP、c-Caspase3蛋白表達,與對照組相比,CINO處理后c-PARP、c-Caspase3蛋白表達水平增加。(5)CINO活化人肝癌細胞SK-Hep1中的eIF2α通路:Western Blot實驗檢測eIF2α通路相關(guān)蛋白表達,與對照組相比,CINO處理后p-eIF2α、ATF4的蛋白表達水平增加;與此同時,PCR檢測XBP1的mRNA水平時發(fā)現(xiàn),與陽性對照TUN組相比,CINO處理組沒有出現(xiàn)XBP1的活化條帶。(6)抑制eIF2α的磷酸化后減弱了CINO誘導(dǎo)的人肝癌細胞SK-Hep1凋亡:轉(zhuǎn)染eIF2α-S51A質(zhì)粒、si-eIF2αRNA后與CINO聯(lián)用,Western blot分析發(fā)現(xiàn)與單獨處理組相比,轉(zhuǎn)染+CINO聯(lián)用組c-PARP蛋白表達水平下調(diào)。(7)CINO抑制人肝癌細胞SK-Hep1中AKT/mTOR通路:Western Blot實驗檢測AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白(p-AKT、p-P70S6K、p-S6)表達時發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CINO處理后AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達水平明顯下調(diào)。(8)抑制AKT/mTOR通路增強CINO誘導(dǎo)的人肝癌細胞SK-Hep1凋亡:LY294002抑制AKT/mTOR通路后,再經(jīng)CINO處理,Western Blot分析發(fā)現(xiàn),與單獨處理組相比,聯(lián)用組c-PARP蛋白表達量明顯升高。(9)活化AKT/mTOR通路可減弱CINO誘導(dǎo)人肝癌細胞SK-Hep1的凋亡:轉(zhuǎn)染AKT活化質(zhì)粒后,Western Blot分析發(fā)現(xiàn),與單獨處理組相比,AKT+CINO聯(lián)用組c-PARP蛋白表達水平明顯下調(diào)。(10)CINO誘導(dǎo)人肝癌細胞SK-Hep1發(fā)生DNA損傷:Western Blot實驗檢測DNA損傷標志蛋白γH2AX的表達發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CINO處理后γH2AX蛋白表達增加。結(jié)論:CINO通過調(diào)控Cyclin d1和P27蛋白的表達將人肝癌細胞SK-Hep1的細胞周期阻滯在G0/G1期,從而抑制了人肝癌細胞SK-Hep1的增殖;CINO可通過活化eIF2α/ATF4通路、抑制AKT/mTOR通路、誘導(dǎo)DNA損傷促使人肝癌細胞SK-Hep1調(diào)亡。
【圖文】：

圖 1. Cinobufagin 對人肝癌細胞 SK-Hep1 增殖的影響re 1. Effects of Cinobufagin on proliferation of human hepatocellular caSK-Hep1A 為不同濃度的 CINO（0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、l/L、200 nmol/L）作用于人肝癌細胞 SK-Hep1 12 h、24 h、48 h 后C 為 SK-Hep1 細胞克隆形成實驗結(jié)果，**P<0.01，VS 對照組（C學(xué)顯微鏡 100 倍下觀察的細胞團。O 阻滯人肝癌細胞 SK-Hep1 的細胞周期胞周期往往與細胞的增殖息息相關(guān)，CINO抑制人肝癌細胞是否與細胞周期有關(guān)呢？如圖 2 所示，用 CINO（50 nm2 h、24 h 后，通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)與對照

圖 2. Cinobufagin 對人肝癌細胞 SK-Hep1 細胞周期的影響Figure 2. Effects of Cinobufagin on the cell cycle of human hepatocellular carcinomacell SK-Hep1圖 2：A 為 FCM（流式細胞術(shù)）測定 CINO（50 nmol/L）作用于人肝癌細胞 SK-Hep6 h、12 h、24 h 后的細胞周期分布；B 為各組細胞 G0/G1、S、G2/M 期的分布，*P<0.05**P<0.01，VS 對照組（CON）。3. CINO 通過下調(diào)人肝癌細胞 SK-Hep1 Cyclin d1 和上調(diào) P27 蛋白的表達影響細胞周期當細胞周期 G0/G1 向 S 期轉(zhuǎn)變時，Cyclin d1 與 P27 蛋白能夠調(diào)控這個過程，因此我們考慮 CINO 是否通過調(diào)控 Cyclin d1 與 P27 蛋白的表達而影響細胞周期。圖 3A-C，用不同濃度 CINO（0 nmol/L，10 mol/L，，50 nmol/L
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2689365