【摘要】：目的多糖由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成,是生物體內(nèi)的大分子化合物。本文采用微波法提取柞蠶蛹中的多糖組分,響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的提取條件,并將多糖進一步分離純化作用于SMMC-7721肝癌細(xì)胞,探究其對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的作用。方法微波法在弱堿性條件下提取柞蠶蛹多糖,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以多糖得率為指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取柞蠶蛹多糖的最佳工藝。Sevag(三氯甲烷:正丁醇=5:1)法除蛋白質(zhì),以H2O2脫除多糖中的色素,苯酚-硫酸法測定柞蠶蛹多糖含量。本課題用透析袋除小分子雜質(zhì)。采用DEAE-52弱陰離子交換層析將多糖純化,選用Sephadex G-150凝膠層析將對腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用的PSP1活性組分進一步純化。CCK-8法檢測不同濃度的柞蠶蛹多糖提取物PSP1組分對SMMC-7721人肝癌細(xì)胞生長的抑制情況。Western blot檢測Bax、Bcl-2和P53蛋白的表達。激光共聚焦免疫熒光檢測P50、P65蛋白的細(xì)胞定位。結(jié)果通過響應(yīng)面法優(yōu)化了弱堿水提取柞蠶蛹多糖的微波提取工藝,最優(yōu)提取工藝的參數(shù)分別為微波時間23 min,微波功率516 W,料液比為1:28,在最佳提取工藝條件下,多糖收率為4.72%,為灰白色粉末,測定多糖含量為71.8%。脫色的最優(yōu)條件為H2O2體積分?jǐn)?shù)25%,在此條件下多糖的脫色率為75.31%,多糖保留率為68.47%。DEAE-52弱陰離子交換層析法,共得到三種多糖組分,分別為PSP1、PSP2、PSP3。將三個組分分別作用于SMMC-7721細(xì)胞,結(jié)果表明PSP1多糖組分對SMMC-7721肝癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。Sephadex G-150凝膠純化PSP1活性組分,洗脫曲線峰形基本對稱,表明PSP1活性組分相對均一且純度較高。CCK-8結(jié)果分析表明,柞蠶蛹多糖提取物對SMMC-7721細(xì)胞的增殖具有抑制作用,且呈時間和濃度依賴性,其24、48和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為6.606、4.114、2.569 mg/m L。Western blot檢測結(jié)果表明,隨著多糖提取物濃度增大,SMMC-7721細(xì)胞Bax、p53蛋白的表達逐漸升高,Bcl-2蛋白的表達逐漸降低。免疫熒光實驗結(jié)果表明,多糖PSP1可能通過抑制NF-κB通路中P65/P50蛋白從細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。結(jié)論從柞蠶蛹中提取多糖,經(jīng)分離純化后得PSP1、PSP2、PSP3,分別作用于SMMC-7721細(xì)胞,結(jié)果表明PSP1對腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用,并呈時間和濃度依賴性,其促凋亡機制可能為增強Bax、P53蛋白的表達,降低Bcl-2蛋白的表達。通過抑制NF-κB通路中P65/P50從細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。實驗初步證實多糖PSP1對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用,為今后抗癌藥物的研制及癌癥的輔助治療提供一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

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本文編號：2687302