【摘要】：流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病,每年都會給人類健康造成嚴(yán)重威脅,給世界經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。目前針對流感的研究主要集中在研發(fā)廣譜流感疫苗和抗流感藥物方面�？沽鞲兴幬镆恢笔侵委熈鞲械闹匾行緩�。但近年來流感病毒耐藥性有所增加,并且耐藥流感病毒株能夠在全世界傳播,這使得解決流感病毒的耐藥性成為研究抗流感病毒藥物的重點和熱點。中醫(yī)抗流感歷史悠久,積累的大量行之有效的抗流感中藥和中藥復(fù)方。中藥具有不同于西藥的抗流感方式,中藥和中藥復(fù)方往往能夠作用于流感病毒復(fù)制過程中的多個靶點,并且很多中藥能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力來治療流感。這使得運用中藥解決流感病毒的耐藥性成為可能。同時,鑒于神經(jīng)氨酸酶(NA)在流感病毒的整個復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用,而中藥能有效治療流感,這提示我們中藥中可能有抑制NA的成分。但目前對于中藥和中藥復(fù)方的研究主要集中于抗流感的作用效果,對其抗流感機(jī)制和發(fā)揮抗流感作用的成分研究較少。此外,中藥和中藥復(fù)方的抗流感藥效較之西藥奧司他韋等還有待提高。目前,流感病毒對現(xiàn)有藥物的耐藥性也是亟待解決的問題。聯(lián)合用藥是解決耐藥性出現(xiàn)、降低藥物的用量、提高臨床療效并且降低藥物毒副作用的有效手段�；谝陨峡紤],本論文研究的主要思路是:從清熱解毒解表類中藥單體化合物中篩選流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑,并通過與奧司他韋聯(lián)合來降低病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)的耐藥性,并且提高中藥單體化合物的療效。在本論文主要研究以下兩部分內(nèi)容:1.從清熱解毒解表類中藥單體化合物文庫中篩選NAI并分析其與NA的相互作用首先從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索兩類經(jīng)典甲型流感病毒NA類型(N1,N2)的三維晶體結(jié)構(gòu)。通過Discovery Studio 3.5軟件將所有的NA蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)去水、去雜原子等以備接下來的實驗所用。隨后,建立清熱解毒解表類中藥單體化合物文庫。在臺灣中國要數(shù)據(jù)庫(TCMs)中,下載發(fā)散風(fēng)寒型解表類中藥防風(fēng)、蒼耳子、辛夷等16種;發(fā)散風(fēng)熱型解表類中藥菊花、升麻、浮萍等12種;清熱解毒類中藥板藍(lán)根、白頭翁、金蕎麥等31種。通過TCMs數(shù)據(jù)庫檢索這59種清熱解毒解表類中藥的單體成分共2981個,下載其三維構(gòu)象,組成小分子化合物文庫。最后,利用AutoDock4.2軟件,以N1,N2為靶點,分別對小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選。通過結(jié)合能打分排序,獲得候選化合物,以用于后續(xù)酶學(xué)實驗。采用底物熒光法檢測候選中藥單體化合物對N1和N2的抑制活性。通過實驗得到了各個候選中藥單體化合物對N1和N2抑制的IC50值,其中中藥單體化合物1、中藥單體化合物2、中藥單體化合物3、中藥單體化合物4和中藥單體化合物5這五種中藥單體化合物對N1和N2的抑制效果較好,IC50值均小于200μM。并用AutoDock4.2軟件將中藥單體化合物1和中藥單體化合物2分別與N1和N2進(jìn)行分子對接,分析中藥單體化合物1和中藥單體化合物2與NA之間的相互作用,結(jié)果表明中藥單體化合物1和中藥單體化合物2與NA之間的相互作用包括氫鍵、疏水相互作用以及靜電相互作用。2.中藥單體化合物1和中藥單體化合物2分別與奧司他韋聯(lián)合對NA的抑制作用及機(jī)制分析兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合使用,能夠解決流感病毒的耐藥性問題,并且有提高抗流感藥物的臨床療效、降低藥物副作用的功效。因此,用聯(lián)合用藥的方式研究中藥單體化合物1和中藥單體化合物2分別與奧司他韋聯(lián)合對NA的抑制效果并用聯(lián)合用藥軟件CalcuSyn2.0分析兩種藥物聯(lián)合的作用效果。實驗結(jié)果顯示中藥單體化合物1與奧司他韋聯(lián)合對N1和N2抑制的CI值均小于1,說明兩種藥物聯(lián)合對N1和N2的抑制呈現(xiàn)協(xié)同作用。中藥單體化合物2和奧司他韋聯(lián)合對N1的抑制也呈現(xiàn)協(xié)同效果,但兩者的聯(lián)合對N2的抑制卻呈現(xiàn)拮抗作用。此外,這兩種藥物與奧司他韋聯(lián)合的劑量減小指數(shù)(DRI)值均大于1,這表明兩種藥物聯(lián)合之后達(dá)到特定抑制效果的劑量均減少,說明兩種藥物聯(lián)合之后的療效均有所提高,有利于降低藥物的毒副作用。在蛋白數(shù)據(jù)庫中找到結(jié)合奧司他韋的NA(N1,N2)晶體結(jié)構(gòu),然后利用AutoDock4.2軟件將中藥單體化合物1分別與結(jié)合奧司他韋的N1和N2對接,分析三者之間的相互作用。分子對接結(jié)果顯示,中藥單體化合物1和奧司他韋聯(lián)合之后與NA的氫鍵相互作用增加,這可能是兩者聯(lián)合對NA的抑制起到協(xié)同作用的原因。通過本研究,篩選出了兩種對N1和N2抑制效果較好的中藥單體化合物中藥單體化合物1和中藥單體化合物2。證實了中藥單體化合物1與西藥奧司他韋聯(lián)合對N1和N2的抑制呈現(xiàn)協(xié)同效果,并且能夠降低每種藥物的使用劑量,減少藥物毒副作用,提高療效。本研究從中藥單體化合物與西藥聯(lián)用對流感病毒關(guān)鍵酶NA的協(xié)同作用角度闡述中藥的作用效果和作用機(jī)制,為中西醫(yī)結(jié)合治療流感的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
【圖文】：

感冒簡稱流感，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病 5% - 10%的人口會感染流感病毒。在非危險個體中，流感通吸道感染。但對于 2 歲以下的兒童、孕婦以及老年人和其它嚴(yán)毒往往會引起嚴(yán)重的肺損傷、腎功能衰竭和急性呼吸系統(tǒng)疾，甚至?xí)䦟?dǎo)致死亡。65 歲以上的老年人患流感的死亡率最高傳染性很強(qiáng)，很容易造成世界范圍內(nèi)的大流行。每次流感大萬到上百萬人死亡。大流行過后，流感病毒株毒力減弱，轉(zhuǎn)化在人群中傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織和美國疾控中心統(tǒng)計，季節(jié)性圍內(nèi)造成約 300 萬至 500 萬嚴(yán)重病例，29 萬至 65 萬例死亡。的監(jiān)測顯示,2018 年整體的流感流行水平明顯高于往年,是近為嚴(yán)重的一次。

圖 1.2 NA 和 NAI 的作用原理圖 1.3 神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用效果。 A：未加入 NAI，病毒粒子正常釋放。B：加入 NAI，子代病毒粒子發(fā)生聚集。表 1.1 NAI 的抑制效果Inhibitor Inhibition (IC50, nmol/L)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;TP311.13

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6 周U，

本文編號：2686113