【摘要】：1研究目的與意義研究目的:本課題重點在于探討中藥注射劑(TCMI)致類過敏反應中肥大細胞脫顆粒反應及補體活化相關機制。通過前期實驗基礎再結合文獻分析,使用易引起類過敏反應的TCMI,采用小鼠腹腔肥大細胞和小鼠類過敏反應動物模型,驗證TCMI所致類過敏反應是否與補體系統(tǒng)的活化有關,即類過敏反應補體活化相關機制(CARPA)學說。研究意義:希望通過本課題的深入研究可以為類過敏反應體內致敏機制的明確提供新的實驗依據,為TCMI致類過敏反應的臨床前評價提供基礎。2研究內容2.1中藥注射劑致肥大細胞脫顆粒的體外實驗在前期實驗基礎上,提取純化小鼠腹腔肥大細胞(MC),并采用甲苯胺藍染色確定,同時進行MC生長特性研究,以此MC作為細胞模型后,對中藥注射劑(TCMI)血栓通、香丹、生脈、黃芪、參麥和雙黃連六種藥物進行靶細胞脫顆粒反應實驗,通過測定各藥物的IC50,再檢測致敏靶細胞組胺、β-氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶三種介質釋放情況,以及計算MC脫顆粒率,為下一步的體內類過敏反應機制實驗確定敏感的TCMI。2.2中藥注射劑致類過敏反應的補體活化相關機制研究在體外確定可導致靶細胞脫顆粒的中藥注射劑(TCMI)基礎上,初次注射藥物后30分鐘內觀察小鼠是否有與類過敏反應相關的行為變化以及小鼠腹部皮膚黏膜是否出現藍斑,并測定TCMI在體內致肥大細胞(MC)釋放生物活性介質(組胺、β-氨基己糖苷酶)的情況;隨后觀察補體系統(tǒng)成分的活化,包括小鼠血清溶血現象觀察、CH50測定及補體結合實驗,以此確定初次致敏的小鼠模型體內是否有補體活化的存在,同時與再次致敏小鼠模型的血清補體溶血反應進行比較;最后采用免疫熒光法和流式細胞術測定MC表面C3aR的變化,以驗證補體活化片段是否通過與MC表面C3aR結合而致脫顆粒反應,通過以上實驗探討TCMI致類過敏反應的補體活化相關機制研究。3研究結果3.1中藥注射劑致肥大細胞脫顆粒的體外實驗3.1.1小鼠腹腔肥大細胞分離、染色和生長特性研究采用Percoll提取、分離得到小鼠腹腔肥大細胞(MC),活性95%,純度90%。通過生長曲線實驗,確定MC培養(yǎng)24h內細胞生長穩(wěn)定,可選擇藥物處理的時間為24h內。3.1.2中藥注射劑體外致肥大細胞脫顆粒實驗選擇血栓通、香丹、生脈、黃芪、參麥和雙黃連六種注射液,測定對肥大細胞(MC)的 IC50 分別為 1.559μl/ml、42.799μl/ml、5.371μl/ml、42.200μl/ml、36.573μl/ml和8.431μl/ml。在IC50濃度下測定體外中藥注射劑(TCMI)致MC脫顆粒率、釋放組胺、β-氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶的釋放率,有統(tǒng)計學意義的為雙黃連和香丹注射液,其中雙黃連注射液致敏作用比香丹注射液強,致MC釋放組胺、β-氨基己糖苷酶的百分率分別為37.61%、32.71%,與陰性組相比P0.01,釋放類胰蛋白酶的百分率為17.71%,與陰性組相比P0.05。MC脫顆粒百分率在0.5h開始增高,2h后逐漸下降。3.2中藥注射劑致類過敏反應的補體活化相關機制研究3.2.1模型小鼠行為、黏膜藍斑觀察及肥大細胞脫顆粒測定建立類過敏反應小鼠模型,分為四組:雙黃連(SHL)組、香丹(XD)組、C48/80組、生理鹽水(NS)組;對小鼠首次注射藥物0.5h內觀察,SHL組小鼠活動減少,但達不到小鼠行為異常的評價標準;SHL組和XD組均有3只以上小鼠腹部皮膚黏膜出現藍斑;中藥注射劑體內致肥大細胞脫顆粒釋放的組胺和β-氨基己糖苷酶釋放率檢測結果顯示,SHL組為35.90%、32.71%;XD組為25.97%、24.09%,與陰性對照組相比具有統(tǒng)計學意義,二者相比SHL組生物活性介質釋放率較高。3.2.2補體活化測定結果補體溶血反應實驗結果為:雙黃連(SHL)組和香丹(XD)組上清OD值分別為0.253±0.020和0.241 ±0.026,與陰性組相比P0.01,具有統(tǒng)計學意義;SHL組血清總補體活性測定(CH50)為78U/mL;SHL組和XD組的補體結合實驗結果為陰性,但再次驗證了 SHL組和XD組小鼠血清中存在活化補體成分。3.2.3初次致敏與再次致敏模型小鼠的補體溶血反應比較選擇雙黃連(SHL)組進行再致敏,初次致敏和再次致敏模型小鼠的行為觀察和腹部皮膚黏膜藍斑觀察結果并沒有明顯的差異性;兩組小鼠血清補體溶血反應結果為:初次致敏組上清測定OD值為0.196±0.029;再次致敏組上清測定OD值為0.182±0.018,兩組與相應的陰性對照組相比P0.01,具有統(tǒng)計學意義,但初次致敏和再次致敏兩組之間沒有顯著性差異。3.2.4肥大細胞表面C3aR檢測肥大細胞(MC)表面C3aR免疫熒光法檢測結果顯示,各實驗組MC表面均存在熒光,雙黃連(SHL)組和香丹(XD)組熒光強度均比NS組強。MC表面C3aR流式細胞術檢測結果顯示,SHL組MC熒光表達百分率分別為27.60%,是NS組的5.41倍;XD組為6.60%,是NS組的1.29倍。4結論(1)通過在經過染色確認、活性測定的肥大細胞模型上進行脫顆�；钚晕镔|檢測和肥大細胞脫顆粒百分率的測定,確認了雙黃連注射液和香丹注射液在體外可致肥大細胞脫顆粒。(2)通過建立小鼠動物模型,在體內測定中藥注射劑同樣可致肥大細胞產生脫顆�，F象,再次驗證了雙黃連注射液和香丹注射液可引起類過敏反應。(3)通過中藥注射劑所致初次致敏小鼠動物模型的補體生物學活性測定,確定了雙黃連注射液和香丹注射液可引起體內補體系統(tǒng)的溶血活性增高,驗證了類過敏反應補體活化相關(CARPA)機制的存在。通過初次致敏與再次致敏比較,認為中藥注射劑引發(fā)的初次致敏和再次致敏小鼠血清均存在補體活化,二者相比沒有顯著性差異。(4)通過進一步測定肥大細胞表面C3aR變化,結果說明了中藥注射劑致靶細胞的脫顆粒反應中,補體活化片段可與肥大細胞上的C3aR結合,導致肥大細胞的脫顆粒反應,進一步說明中藥注射劑所致類過敏反應與CARPA機制密切相關。
【圖文】：

正常的ＭＣ呈圓形或卵圓形，表面光滑，，細胞輪廓清晰，孔中細胞均勻逡逑分布。用Ｐｅｒｃｏｌｌ分離得到的單只昆明小鼠的ＭＣ總數為１Ｘ１０６個左右，細胞活逡逑力＞９５％，能夠滿足后續(xù)實驗要求，結果見圖１－１。逡逑＿逡逑圖１－１小鼠腹腔肥大細胞（Ｘ１００）逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ逡逑３．邋２肥大細胞甲苯胺藍染色逡逑提取的小鼠腹腔肥大細胞（ＭＣ）經過甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡下觀察逡逑細胞形態(tài)及染色性的情況。在放大１０００倍的油鏡下可觀察到正常ＭＣ被染成藍逡逑色，染色均勻，細胞輪廓清楚，但正常細胞觀察不到明顯的細胞內顆粒，ＭＣ純逡逑度＞９０％，結果如圖１－２。逡逑２５逡逑

邐＾邐＾邋＊邋＇逡逑？邋？邋？邋＊邋？逡逑圖１－２肥大細胞甲苯胺藍染色結果（Ｘ邋１０００）逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅＨｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑３．邋３肥大細胞生長曲線測定逡逑對數生長期細胞新陳代謝活躍，對外界敏感性較強，是進行藥理實驗的良好逡逑對象。為了尋找出進行藥物實驗的較佳時間要進行肥大細胞（ＭＣ）生長曲線的逡逑測定。在實驗中設定六個時間檢測點對ＭＣ進行生長測定，ＭＣ接種濃度為ＩＸ逡逑１０５個／ｍｌ。觀察ＭＣ培養(yǎng)２４ｈ內生長穩(wěn)定，而２４ｈ后生長開始下降，此后呈衰退逡逑趨勢，結果見圖１－３。逡逑０．７邋－逡逑�！义希埃冲澹义�0２－逡逑０．１邋－逡逑０．０邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｏｈ邐１２ｈ邐２４ｈ邐３６邋ｈ邐４８ｈ邐６０ｈ逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖１＿３肥大細胞生長曲線逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．邋４中藥注射劑對肥大細胞半數抑制濃度（ＩＣ５。）測定逡逑經測定各組中藥注射劑（ＴＣＭＩ）對肥大細胞（ＭＣ）的半數抑制濃度（ＩＣ５０）逡逑為：血栓通（ＸＳＴ）組為邋１．５５９ｊｉｌ／ｍｌ；香丹（ＸＤ）組為邋４２．７９９卩邋１／ｍｌ；生脈（ＳｈｅｎｇＭ）逡逑組為邋５．３７１ｐｌ／ｍｌ；黃芪（ＨＱ）組為邋４２．２０0ｎｌ／ｍｌ；參麥（ＳｈｅｎＭ）組為邋３６．５７３ｎｌ／ｍｌ；逡逑雙黃連（ＳＨＬ）組為８．４３１ｎｌ／ｍｌ。由結果可見ＸＳＴ、ＳｈｅｎｇＭ和ＳＨＬ三組逡逑ＩＣ５０＜ｌ0ｎｌ／ｍｌ
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 陳夢;李偉;王雪;黃芝瑛;耿興超;李波;;藥物類過敏反應發(fā)生機制及臨床前評價方法研究進展[J];中國新藥雜志;2017年01期

2 吳秀;江益平;李娜;曹亮;丁崗;王振中;蕭偉;;鈣離子變化應用于中藥注射劑類過敏性評價的可行性研究[J];中藥藥理與臨床;2016年04期

3 王化龍;李振虎;吳紅華;高秀梅;徐硯通;;一種藥物注射劑類過敏反應高內涵檢測方法的初步建立[J];中國中藥雜志;2016年10期

4 張瑞瑞;劉艷萍;聶西周;楊東花;劉峰;;射干抗病毒注射液致類過敏反應初步研究[J];世界中醫(yī)藥;2016年04期

5 李彥林;周云豐;李琳;許揚;;雙黃連注射液及其中間品對RBL-2H3細胞增殖的影響[J];中國實驗方劑學雜志;2016年07期

6 李偉;武璐璐;姜華;汪巨峰;李波;;中藥注射劑過敏及類過敏反應體外評價方法的初步建立[J];世界中西醫(yī)結合雜志;2016年03期

7 江生;汪敏;白亞敏;韓燕;;用可見-紫外分光光度法測定水產品中組胺的含量[J];食品工程;2016年01期

8 王歡;王慶甫;王慶國;;清開靈注射液及其中間品類過敏反應的實驗研究[J];遼寧中醫(yī)雜志;2015年10期

9 韓佳寅;易艷;梁愛華;張宇實;李春英;趙雍;王連嵋;盧禹婷;李桂琴;;藥物過敏和類過敏的臨床前評價要求概述[J];中國中藥雜志;2015年14期

10 徐煜彬;竇德強;;中藥注射劑類過敏研究進展[J];中國中藥雜志;2015年14期

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1 陳玉瓊;不同劑型中藥致類過敏實驗研究[D];廣東藥學院;2015年

本文編號：2685996