【摘要】：1研究目的與意義研究目的:本課題重點(diǎn)在于探討中藥注射劑(TCMI)致類過(guò)敏反應(yīng)中肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)及補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制。通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)再結(jié)合文獻(xiàn)分析,使用易引起類過(guò)敏反應(yīng)的TCMI,采用小鼠腹腔肥大細(xì)胞和小鼠類過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型,驗(yàn)證TCMI所致類過(guò)敏反應(yīng)是否與補(bǔ)體系統(tǒng)的活化有關(guān),即類過(guò)敏反應(yīng)補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制(CARPA)學(xué)說(shuō)。研究意義:希望通過(guò)本課題的深入研究可以為類過(guò)敏反應(yīng)體內(nèi)致敏機(jī)制的明確提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為T(mén)CMI致類過(guò)敏反應(yīng)的臨床前評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。2研究?jī)?nèi)容2.1中藥注射劑致肥大細(xì)胞脫顆粒的體外實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,提取純化小鼠腹腔肥大細(xì)胞(MC),并采用甲苯胺藍(lán)染色確定,同時(shí)進(jìn)行MC生長(zhǎng)特性研究,以此MC作為細(xì)胞模型后,對(duì)中藥注射劑(TCMI)血栓通、香丹、生脈、黃芪、參麥和雙黃連六種藥物進(jìn)行靶細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)實(shí)驗(yàn),通過(guò)測(cè)定各藥物的IC50,再檢測(cè)致敏靶細(xì)胞組胺、β-氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶三種介質(zhì)釋放情況,以及計(jì)算MC脫顆粒率,為下一步的體內(nèi)類過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制實(shí)驗(yàn)確定敏感的TCMI。2.2中藥注射劑致類過(guò)敏反應(yīng)的補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制研究在體外確定可導(dǎo)致靶細(xì)胞脫顆粒的中藥注射劑(TCMI)基礎(chǔ)上,初次注射藥物后30分鐘內(nèi)觀察小鼠是否有與類過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的行為變化以及小鼠腹部皮膚黏膜是否出現(xiàn)藍(lán)斑,并測(cè)定TCMI在體內(nèi)致肥大細(xì)胞(MC)釋放生物活性介質(zhì)(組胺、β-氨基己糖苷酶)的情況;隨后觀察補(bǔ)體系統(tǒng)成分的活化,包括小鼠血清溶血現(xiàn)象觀察、CH50測(cè)定及補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn),以此確定初次致敏的小鼠模型體內(nèi)是否有補(bǔ)體活化的存在,同時(shí)與再次致敏小鼠模型的血清補(bǔ)體溶血反應(yīng)進(jìn)行比較;最后采用免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定MC表面C3aR的變化,以驗(yàn)證補(bǔ)體活化片段是否通過(guò)與MC表面C3aR結(jié)合而致脫顆粒反應(yīng),通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)探討TCMI致類過(guò)敏反應(yīng)的補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制研究。3研究結(jié)果3.1中藥注射劑致肥大細(xì)胞脫顆粒的體外實(shí)驗(yàn)3.1.1小鼠腹腔肥大細(xì)胞分離、染色和生長(zhǎng)特性研究采用Percoll提取、分離得到小鼠腹腔肥大細(xì)胞(MC),活性95%,純度90%。通過(guò)生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn),確定MC培養(yǎng)24h內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定,可選擇藥物處理的時(shí)間為24h內(nèi)。3.1.2中藥注射劑體外致肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)選擇血栓通、香丹、生脈、黃芪、參麥和雙黃連六種注射液,測(cè)定對(duì)肥大細(xì)胞(MC)的 IC50 分別為 1.559μl/ml、42.799μl/ml、5.371μl/ml、42.200μl/ml、36.573μl/ml和8.431μl/ml。在IC50濃度下測(cè)定體外中藥注射劑(TCMI)致MC脫顆粒率、釋放組胺、β-氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶的釋放率,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的為雙黃連和香丹注射液,其中雙黃連注射液致敏作用比香丹注射液強(qiáng),致MC釋放組胺、β-氨基己糖苷酶的百分率分別為37.61%、32.71%,與陰性組相比P0.01,釋放類胰蛋白酶的百分率為17.71%,與陰性組相比P0.05。MC脫顆粒百分率在0.5h開(kāi)始增高,2h后逐漸下降。3.2中藥注射劑致類過(guò)敏反應(yīng)的補(bǔ)體活化相關(guān)機(jī)制研究3.2.1模型小鼠行為、黏膜藍(lán)斑觀察及肥大細(xì)胞脫顆粒測(cè)定建立類過(guò)敏反應(yīng)小鼠模型,分為四組:雙黃連(SHL)組、香丹(XD)組、C48/80組、生理鹽水(NS)組;對(duì)小鼠首次注射藥物0.5h內(nèi)觀察,SHL組小鼠活動(dòng)減少,但達(dá)不到小鼠行為異常的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn);SHL組和XD組均有3只以上小鼠腹部皮膚黏膜出現(xiàn)藍(lán)斑;中藥注射劑體內(nèi)致肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的組胺和β-氨基己糖苷酶釋放率檢測(cè)結(jié)果顯示,SHL組為35.90%、32.71%;XD組為25.97%、24.09%,與陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,二者相比SHL組生物活性介質(zhì)釋放率較高。3.2.2補(bǔ)體活化測(cè)定結(jié)果補(bǔ)體溶血反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:雙黃連(SHL)組和香丹(XD)組上清OD值分別為0.253±0.020和0.241 ±0.026,與陰性組相比P0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SHL組血清總補(bǔ)體活性測(cè)定(CH50)為78U/mL;SHL組和XD組的補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性,但再次驗(yàn)證了 SHL組和XD組小鼠血清中存在活化補(bǔ)體成分。3.2.3初次致敏與再次致敏模型小鼠的補(bǔ)體溶血反應(yīng)比較選擇雙黃連(SHL)組進(jìn)行再致敏,初次致敏和再次致敏模型小鼠的行為觀察和腹部皮膚黏膜藍(lán)斑觀察結(jié)果并沒(méi)有明顯的差異性;兩組小鼠血清補(bǔ)體溶血反應(yīng)結(jié)果為:初次致敏組上清測(cè)定OD值為0.196±0.029;再次致敏組上清測(cè)定OD值為0.182±0.018,兩組與相應(yīng)的陰性對(duì)照組相比P0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但初次致敏和再次致敏兩組之間沒(méi)有顯著性差異。3.2.4肥大細(xì)胞表面C3aR檢測(cè)肥大細(xì)胞(MC)表面C3aR免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組MC表面均存在熒光,雙黃連(SHL)組和香丹(XD)組熒光強(qiáng)度均比NS組強(qiáng)。MC表面C3aR流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,SHL組MC熒光表達(dá)百分率分別為27.60%,是NS組的5.41倍;XD組為6.60%,是NS組的1.29倍。4結(jié)論(1)通過(guò)在經(jīng)過(guò)染色確認(rèn)、活性測(cè)定的肥大細(xì)胞模型上進(jìn)行脫顆�；钚晕镔|(zhì)檢測(cè)和肥大細(xì)胞脫顆粒百分率的測(cè)定,確認(rèn)了雙黃連注射液和香丹注射液在體外可致肥大細(xì)胞脫顆粒。(2)通過(guò)建立小鼠動(dòng)物模型,在體內(nèi)測(cè)定中藥注射劑同樣可致肥大細(xì)胞產(chǎn)生脫顆�，F(xiàn)象,再次驗(yàn)證了雙黃連注射液和香丹注射液可引起類過(guò)敏反應(yīng)。(3)通過(guò)中藥注射劑所致初次致敏小鼠動(dòng)物模型的補(bǔ)體生物學(xué)活性測(cè)定,確定了雙黃連注射液和香丹注射液可引起體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的溶血活性增高,驗(yàn)證了類過(guò)敏反應(yīng)補(bǔ)體活化相關(guān)(CARPA)機(jī)制的存在。通過(guò)初次致敏與再次致敏比較,認(rèn)為中藥注射劑引發(fā)的初次致敏和再次致敏小鼠血清均存在補(bǔ)體活化,二者相比沒(méi)有顯著性差異。(4)通過(guò)進(jìn)一步測(cè)定肥大細(xì)胞表面C3aR變化,結(jié)果說(shuō)明了中藥注射劑致靶細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)中,補(bǔ)體活化片段可與肥大細(xì)胞上的C3aR結(jié)合,導(dǎo)致肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng),進(jìn)一步說(shuō)明中藥注射劑所致類過(guò)敏反應(yīng)與CARPA機(jī)制密切相關(guān)。
【圖文】：

正常的ＭＣ呈圓形或卵圓形，表面光滑，，細(xì)胞輪廓清晰，孔中細(xì)胞均勻逡逑分布。用Ｐｅｒｃｏｌｌ分離得到的單只昆明小鼠的ＭＣ總數(shù)為１Ｘ１０６個(gè)左右，細(xì)胞活逡逑力＞９５％，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)果見(jiàn)圖１－１。逡逑＿逡逑圖１－１小鼠腹腔肥大細(xì)胞（Ｘ１００）逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ逡逑３．邋２肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色逡逑提取的小鼠腹腔肥大細(xì)胞（ＭＣ）經(jīng)過(guò)甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察逡逑細(xì)胞形態(tài)及染色性的情況。在放大１０００倍的油鏡下可觀察到正常ＭＣ被染成藍(lán)逡逑色，染色均勻，細(xì)胞輪廓清楚，但正常細(xì)胞觀察不到明顯的細(xì)胞內(nèi)顆粒，ＭＣ純逡逑度＞９０％，結(jié)果如圖１－２。逡逑２５逡逑

邐＾邐＾邋＊邋＇逡逑？邋？邋？邋＊邋？逡逑圖１－２肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果（Ｘ邋１０００）逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅＨｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑３．邋３肥大細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定逡逑對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞新陳代謝活躍，對(duì)外界敏感性較強(qiáng)，是進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)的良好逡逑對(duì)象。為了尋找出進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)的較佳時(shí)間要進(jìn)行肥大細(xì)胞（ＭＣ）生長(zhǎng)曲線的逡逑測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定六個(gè)時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)對(duì)ＭＣ進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)定，ＭＣ接種濃度為ＩＸ逡逑１０５個(gè)／ｍｌ。觀察ＭＣ培養(yǎng)２４ｈ內(nèi)生長(zhǎng)穩(wěn)定，而２４ｈ后生長(zhǎng)開(kāi)始下降，此后呈衰退逡逑趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖１－３。逡逑０．７邋－逡逑�！义希埃冲澹义�0２－逡逑０．１邋－逡逑０．０邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｏｈ邐１２ｈ邐２４ｈ邐３６邋ｈ邐４８ｈ邐６０ｈ逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖１＿３肥大細(xì)胞生長(zhǎng)曲線逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．邋４中藥注射劑對(duì)肥大細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５。）測(cè)定逡逑經(jīng)測(cè)定各組中藥注射劑（ＴＣＭＩ）對(duì)肥大細(xì)胞（ＭＣ）的半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５０）逡逑為：血栓通（ＸＳＴ）組為邋１．５５９ｊｉｌ／ｍｌ；香丹（ＸＤ）組為邋４２．７９９卩邋１／ｍｌ；生脈（ＳｈｅｎｇＭ）逡逑組為邋５．３７１ｐｌ／ｍｌ；黃芪（ＨＱ）組為邋４２．２０0ｎｌ／ｍｌ；參麥（ＳｈｅｎＭ）組為邋３６．５７３ｎｌ／ｍｌ；逡逑雙黃連（ＳＨＬ）組為８．４３１ｎｌ／ｍｌ。由結(jié)果可見(jiàn)ＸＳＴ、ＳｈｅｎｇＭ和ＳＨＬ三組逡逑ＩＣ５０＜ｌ0ｎｌ／ｍｌ
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2685996