【摘要】：目的:研究中藥山藥有效成分薯蕷皂苷(Dioscin,DIO)對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活性和成骨性分化的影響,確定最佳活性濃度及處理時(shí)間。通過檢測(cè)β-catenin,runx2,Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平,探討薯蕷皂苷影響MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)理。方法:1.通過熒光倒置顯微鏡觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)。2.不同濃度(1,0.1,0.01,0.001,0μM)DIO分別處理細(xì)胞24h、48h、72h,MTT法檢測(cè)DIO作用不同時(shí)間對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響,分析促增殖能力的活性濃度及最佳時(shí)間。DIO分別作用細(xì)胞最佳時(shí)間后,碘化丙啶染色,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,Real-time PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki67、PCNA mRNA的表達(dá)。3.不同濃度(1,0.1,0.01,0.001,0μM)DIO處理細(xì)胞15d,磷酸苯二鈉法檢測(cè)DIO對(duì)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶ALP活性的影響,處理細(xì)胞21d,茜素紅染色檢測(cè)DIO對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響。Real-time PCR檢測(cè)DIO處理細(xì)胞48h對(duì)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物BGP、OPN m RNA表達(dá)的影響。4.Real-time PCR法檢測(cè)活性濃度(0.01,0.001μM)DIO處理MC3T3-E1細(xì)胞48h后β-catenin,runx2,Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平。5.活性濃度(0.01,0.001μM)DIO處理MC3T3-E1細(xì)胞48h后,Western-blot法檢測(cè)蛋白β-catenin,runx2,Cyclin D1的表達(dá)水平。結(jié)果:1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,0.01,0.001μM濃度組的DIO在作用24h、48h后,均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P0.05),作用48h促增殖效果較強(qiáng)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,0.01,0.001μM濃度組的DIO作用成骨細(xì)胞48h后,能夠顯著增加細(xì)胞周期S期的比例(P0.05)。2.Real-time結(jié)果顯示,0.01μM DIO減少Ki67 m RNA的表達(dá)(P0.01),而0.001μM DIO增加Ki67 m RNA的表達(dá)(P0.05);各濃度的DIO對(duì)PCNA基因的轉(zhuǎn)錄無明顯影響(P0.05)。3.DIO處理細(xì)胞15d后,ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示,0.01,0.001μM濃度組的DIO顯著提高成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性(P0.01)。作用21d后,茜素紅染色結(jié)果顯示,0.01,0.001μM濃度組的DIO提高成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)量(P0.001)。4.Real-time PCR結(jié)果顯示BGP,OPN基因的轉(zhuǎn)錄水平提高(P0.05)。5.Real-time PCR結(jié)果顯示,(0.01,0.001μM)DIO runx2,Cyclin D1 m RNA的轉(zhuǎn)錄(P0.01),降低β-catenin m RNA的轉(zhuǎn)錄(P0.001)。6.Western-blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因β-catenin,runx2,Cyclin D1的翻譯水平均下降(P0.05)。結(jié)論:薯蕷皂苷具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨性分化的作用,并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞骨基質(zhì)的鈣化。其中以0.01μM及0.001μM的薯蕷皂苷作用最為明顯。薯蕷皂苷可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。
【圖文】：

MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)（100X）

15圖 2 MC3T3-E1 細(xì)胞形態(tài)（200X）Fig. 2 Morphology of MC3T3-E1 cells MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響 DIO 作用 MC3T3-E1 細(xì)胞 24h 后，與 0μM 對(duì)照組相比，，0.1μ 濃度的 DIO 均能顯著促進(jìn) MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活性（P＜0.01）細(xì)胞增殖（P＜0.001）；不同濃度 DIO 作用 MC3T3-E1 細(xì)胞 48比， 0.01μM、0.001μM 濃度的 DIO 均能顯著促進(jìn) MC3T3-E
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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