【摘要】：1研究目的龜甲為龜科動物烏龜Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲。藥用歷史悠久,應(yīng)用廣泛。龜甲多以龜甲飲片、醋制龜甲等形式入藥,需求量大。動物類藥材在炮制成飲片的過程中,其外在可視特征與內(nèi)含化學(xué)成分均會產(chǎn)生很大變化,研究的難度也隨之增加,相關(guān)報道較少。蛋白、氨基酸類成分為龜甲的主要藥效物質(zhì),2015版《中國藥典》僅規(guī)定對龜甲的性狀、薄層色譜(TLC)進行鑒別,遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到對其質(zhì)量進行控制的目的。為完善龜甲質(zhì)量控制體系,本實驗采用柱前衍生化AQC高效液相色譜法及非標(biāo)記定量Label Free技術(shù)對龜甲及其炮制品的氨基酸、肽段、蛋白進行研究。采用柱前衍生化AQC-HPLC法對龜甲及其炮制品中的氨基酸進行測定,比較龜甲炮制前后氨基酸類成分在種類、含量上的變化。采用非標(biāo)記定量Label Free技術(shù),通過蛋白提取、還原烷基化和酶解、肽段定量、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)庫搜索等,對龜甲及其炮制品進行蛋白組學(xué)分析,明確龜甲炮制前后的差異蛋白,對龜甲全蛋白進行功能注釋,并對差異蛋白進行GO富集及Pathway富集分析;同時,本實驗還聚焦當(dāng)前備受關(guān)注的中藥材微生物污染問題,采用形態(tài)觀察、顯微鑒定、DNA條形碼技術(shù)3種方法結(jié)合高通量測序技術(shù)對龜甲及其炮制品表面真菌多樣性進行研究,綜合對比龜甲炮制前后表面真菌差異,為更好對龜甲進行質(zhì)量安全評價提供依據(jù)。2研究內(nèi)容與研究方法2.1樣品收集分別從河北安國、安徽亳州、四川成都等藥材市場及北京各大藥店共收集17批生龜甲、17批醋龜甲。并按2015版《中國藥典》中龜甲炮制方法,自制3批醋龜甲。2.2基于柱前衍生化AQC高效液相色譜法的龜甲及其炮制品中氨基酸類成分研究通過柱前衍生化AQC高效液相色譜法對龜甲及其炮制品進行多種氨基酸的含量測定,包括谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等,分析龜甲炮制前后氨基酸的種類、含量的變化。2.3基于非標(biāo)記定量Label Free技術(shù)的龜甲及其炮制品的蛋白組學(xué)研究采用非標(biāo)記定量Label Free方法對龜甲及其炮制品進行蛋白組學(xué)研究,明確龜甲炮制前后的差異蛋白,對龜甲全蛋白進行功能注釋,并對差異蛋白的GO富集及Pathway富集進行分析。2.4龜甲及其炮制品表面真菌的培養(yǎng)與鑒定無菌水洗脫龜甲及其炮制品表面真菌,采用平板法培養(yǎng)真菌。采用形態(tài)觀察、顯微鑒定、DNA條形碼3種方法鑒定龜甲表面真菌。2.5基于高通量測序技術(shù)的龜甲及其炮制品表面真菌多樣性研究基于Illumina HiSeq測序平臺的高通量測序技術(shù)對龜甲及其炮制品表面真菌多樣性進行研究。對龜甲表面真菌進行物種劃分。3研究結(jié)果3.1通過對龜甲炮制前后所含氨基酸的種類及含量分析可知,龜甲生品的氨基酸總量和炮制品的氨基酸總量具有顯著差異,生品的氨基酸總量高于炮制品。龜甲生品的氨基酸總量的含量范圍為24.38～35.33%,平均含量為28.77%,;龜甲炮制品的氨基酸總量的含量范圍為19.51～25.67%,平均含量為22.92%。龜甲生品和炮制品的共有氨基酸為15種,炮制品相比生品減少胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Tyr)2種氨基酸。在共有的15種氨基酸中,含量最高的三種氨基酸依次為甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸,三種氨基酸在龜甲生品中平均含量分別為6.04%、3.04%、2.80%,在龜甲炮制品中平均含量為5.40%、2.65%、2.42%。龜甲生品與炮制品中所含各類氨基酸的含量高低趨勢基本相同。3.2基于非標(biāo)記定量Label Free技術(shù)對龜甲及其炮制品的蛋白組學(xué)進行研究,一共檢索到179個肽段、55個蛋白。龜甲及其炮制品的蛋白分子量多集中在80KDa以下。龜甲生品和炮制品的相關(guān)系數(shù)范圍在0.17～0.48,表明龜甲生品和炮制品之間在蛋白水平上的表達(dá)相似度具有一定差異。龜甲生品與炮制品的共有蛋白為30個,其中16個蛋白在炮制品中有較大程度的降解,14個蛋白無明顯差異;龜甲生品中特有蛋白有23個,故龜甲生品與炮制品的差異蛋白共39個。對龜甲蛋白進行功能注釋,經(jīng)GO分析可知,龜甲的蛋白功能主要與細(xì)胞和生物代謝過程相關(guān)。對龜甲生品及其炮制品的差異蛋白進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)特異富集GO功能涉及氧化還原、單體分解代謝、一元羧酸代謝、有機物分解、磷酸核苷代謝、磷酸核糖代謝等多個細(xì)胞代謝過程;經(jīng)KEGG Pathway分析可知,龜甲的蛋白功能主要涉及人類疾病、生物體系統(tǒng)等代謝途徑。對龜甲生品及其炮制品的差異蛋白進行Pathway富集分析,發(fā)現(xiàn)特異富集KEGG Pathway涉及HIF-1信號、鈣信號、細(xì)胞凋亡、阿爾茨海默病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多條代謝通路。3.3通過對龜甲表面的真菌進行培養(yǎng)與鑒定,發(fā)現(xiàn)龜甲生品與炮制品表面真菌具有一定差異。數(shù)目上,生龜甲表面真菌數(shù)量多于醋龜甲;種類上,醋龜甲表面真菌種類多于生龜甲;生龜甲表面多為曲霉屬真菌,醋龜甲表面曲霉屬、青霉屬真菌較多。生龜甲,醋龜甲表面均未檢測到黃曲霉菌。3.4基于高通量測序技術(shù)對龜甲及其炮制品表面真菌多樣性進行研究。通過評估各階段樣品的序列數(shù)目,序列長度,GC含量,Q20和Q30質(zhì)量值,Effective等參數(shù),表明測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量優(yōu),正確率高。同時綜合衡量了各樣品的ACE、Chao1、Simpson、Shannon等Alpha多樣性指數(shù),證明測序結(jié)果真實地反映了龜甲生品及炮制品表面真菌多樣性情況。對龜甲及其炮制品表面真菌進行物種分類,龜甲生品及炮制品表面真菌主要由擔(dān)子菌門及子囊菌門2個門的真菌組成。龜甲表面豐度較高的真菌包括曲霉屬、孢子絲屬、念珠菌屬、畢赤酵母屬、節(jié)擔(dān)菌屬、枝孢菌屬、蟲草屬、黃萎病屬及青霉屬真菌。龜甲生品和炮制品表面真菌的組成具有一定差異。生品表面豐度最高的為曲霉屬真菌,其次為孢子絲屬真菌、念珠菌屬真菌排第三。炮制品表面則主要由孢子絲屬真菌與曲霉屬真菌組成。4結(jié)論4.1柱前衍生化AQC高效液相色譜法能夠?qū)敿准捌渑谥破分械陌被徇M行定性定量測定,為更好對龜甲進行質(zhì)量控制提供依據(jù)。4.2利用Label Free技術(shù)對龜甲及其炮制品進行蛋白組學(xué)相關(guān)內(nèi)容的研究,可得到其差異蛋白及蛋白功能信息,能夠為后續(xù)更深入挖掘龜甲藥理活性奠定基礎(chǔ)。4.3形態(tài)觀察、顯微鑒定、DNA條形碼技術(shù)集合高通量測序能夠全面地對龜甲及其炮制品表面真菌多樣性進行研究。能夠更好地對龜甲藥材的質(zhì)量安全進行評價,指導(dǎo)龜甲臨床合理用藥。5創(chuàng)新點首次采用非標(biāo)記定量Label Free技術(shù)對龜甲及其炮制品進行蛋白組學(xué)研究。首次應(yīng)用形態(tài)觀察、顯微鑒定、DNA條形碼結(jié)合高通量測序技術(shù)綜合評價龜甲表面真菌多樣性。
【圖文】：

邐ＩＩ邋Ｉ？邋１３邋Ｈ邋１５邋Ｉｆｌ邋１７邋１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３逡逑圖３－１生龜甲圖邐圖３－２醋龜甲圖逡逑２．２色譜條件逡逑色譜柱：Ｗａｔｅｒｓ邋ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法專用Ｃｉ８色譜柱（３．９Ｘ１５０邋ｍｍ，３邋（ｉｍ），流動相Ａ為逡逑ＡｃｃＱ．Ｔａｇ流動相的ＭＯ稀釋液

２２邋Ｍ邋２４邐ＩＩ邋Ｉ？邋１３邋Ｈ邋１５邋Ｉｆｌ邋１７邋１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３逡逑圖３－１生龜甲圖邐圖３－２醋龜甲圖逡逑２．２色譜條件逡逑色譜柱：Ｗａｔｅｒｓ邋ＡｃｃＱ．Ｔａｇ法專用Ｃｉ８色譜柱（３．９Ｘ１５０邋ｍｍ，３邋（ｉｍ），，流動相Ａ為逡逑ＡｃｃＱ．Ｔａｇ流動相的ＭＯ稀釋液
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉艷;張振凌;蘆錳;于文娜;李清正;;正交法優(yōu)選龜甲膠原料龜甲的炮制提取工藝[J];中國現(xiàn)代中藥;2018年02期

2 石萍;魯增輝;游華建;陳仕江;;龜甲膠的現(xiàn)代研究進展[J];中國民族民間醫(yī)藥;2018年02期

3 龍小艷;陳瑩;費毅琴;肖凌;聶晶;黃志軍;;龜甲及龜甲膠中25種金屬及有害元素含量測定及初步風(fēng)險評估[J];藥物分析雜志;2019年05期

4 唐宇;肖丹;劉子毓;王磊;羅麗云;何清湖;;龜甲膠的研究現(xiàn)狀及展望[J];中華中醫(yī)藥雜志;2019年06期

5 徐清;李夢;張帆;孟杰親;羅雪梅;劉春生;楊瑤s

本文編號：2681304