【摘要】：目的:研究補腎活血湯對兔軟骨細胞的增殖作用及對細胞因子IL-1、IL-6、IGF-1、TGF-βmRNA和NF-kbp65蛋白表達水平的影響,并初步探討其對骨質疏松癥并骨性關節(jié)炎兩者共病的作用,為補腎活血法治療兩者共病提供理論依據。方法:30只新西蘭雌性大白兔,被隨機分為A(OP模型組,n=10)、B(OA模型組,n=10)、C組(OP并OA模型組,n=10)三組。A組按Calvo的造模方法進行OP造模,B組按Hulth的造模方法進行OA造模,C組綜合上述兩組造模方式進行OP并OA造模,各組均提取右膝關節(jié)軟骨組織分離培養(yǎng)軟骨細胞。MTT法觀察7組含藥血清(正常血清組、低劑量補腎活血湯組、中劑量補腎活血湯組、高劑量補腎活血湯組、鹽酸氨基葡萄糖組、阿侖膦酸鈉組、鹽酸氨基葡萄糖+阿侖磷酸鈉組)對兔軟骨細胞增殖的影響;PCR法檢測7組藥物對兔軟骨細胞中細胞因子IL-1、IL-6、IGF-1、TGF-βmRNA表達的影響;蛋白印跡法(Western blot)檢測7組藥物對兔軟骨細胞NF-kbp65蛋白相對表達量的影響。結果:1.A、B、C三組細胞隨著傳代數的增加,Ⅱ型膠原免疫組化的MOD呈現一個遞減趨勢,即P1P3P5,且Pi、P3、P5之間差異具有顯著性(P0.05)。在固定細胞代數的情況下,三組細胞在P1及P3對比差異有顯著性(P0.05),但在P5期,三組軟骨細胞對比差異無顯著性(F=2.180,P=0.1480.05),進一步兩兩比較發(fā)現A組與C組在P1及P3期比較,差異有顯著性(P0.05)。2.MTT檢測法顯示:隨著藥物作用時間的延長至第7天。(1)除B組細胞中低劑量組與正常組對比,差異無顯著性(t=-2.152,p=0.0980.05)外,其他各劑量補腎活血湯組與正常組對比OD值均增高,差異均有顯著性(P0.05)。由此可知補腎活血湯有促軟骨細胞增殖的作用。(2)高劑量組與低劑量組對比OD值增高,差異有顯著性(P0.05),低劑量組與中劑量組及中劑量組與高劑量組在B、C組中對比,差異有顯著性(P0.05)。且在A、B、C三組中OD值高劑量組中劑量組低劑量組。由此可知三種劑量的補腎活血湯中,高劑量組促軟骨細胞增殖作用最明顯,補腎活血湯促軟骨細胞增殖作用呈現劑量-時間-效益關系。(3)高劑量組與阿侖組及鹽酸組對比,除高劑量組與鹽酸組在A組細胞中差異無顯著性(t=1.566,p=0.1920.05)外,高劑量組在其他組中的作用均優(yōu)于阿侖組及鹽酸組,差異有顯著性(P0.05);高劑量組與鹽+阿組對比,在三組細胞中差異均無顯著性(P0.05)。由此可知高劑量組促軟骨細胞增殖作用與鹽+阿組相當,優(yōu)于阿侖組及鹽酸組。3.PCR結果顯示:(1)各劑量補腎活血湯組與正常組比較,除低劑量補腎活血湯組在OA組中與正常組對比差異無統(tǒng)計學意義外(t=2.866,P=0.0580.05),其它劑量補腎活血湯與正常組對比均有降低軟骨細胞內IL-1mRNA表達的作用,差異有顯著性(P0.05),其中以高劑量組的下調幅度最為明顯,與低、中劑量組比較差異有顯著性(P0.05);高劑量組與鹽酸組對比IL-mRNA表達更低,差異有顯著性(P0.05),高劑量組與阿侖組及鹽+阿組對比在OP組及OA+OP組中差異不顯著(P0.05),但在OA組中差異有顯著性(P0.05)。由此可知高劑量組降低IL-1mRNA的表達作用優(yōu)于鹽酸組與阿侖組及鹽+阿組大體相當。(2)各劑量補腎活血湯組與正常組對比均有降低細胞內IL-6mRNA表達的作用,其中以高劑量組降低IL-6mRNA表達作用最明顯,與低、中劑量組對比,差異有顯著性(P0.05);高劑量組與阿侖組對比降低IL-6mRNA作用更明顯,差異有顯著性(P0.05),高劑量組與鹽+阿組對比差異無顯著性(P0.05),高劑量組與鹽酸組在OA組中對比,差異無顯著性(t=-1.399,p=0.2110.05),在OP組及OA+OP組中降低IL-6mRNA作用更明顯,差異均有顯著性(P0.05)。由此可知高劑量組降低細胞內IL-6mRNA的表達作用與鹽+阿組相當,優(yōu)于阿侖組及鹽酸組。(3)中、高劑量組與正常組對比均有增高細胞內IGF-1mRNA表達的作用,差異有顯著性(P0.05),且中劑量組與高劑量組對比,差異有顯著性(P0.05);高劑量組與阿侖組對比升高IGF-1mRNA表達的作用更明顯,差異有顯著性(P0.05),高劑量組與鹽酸組及鹽+阿組對比在三組細胞中差異無顯著性(P0.05)。(4)各劑量補腎活血湯組與正常組對比,均有升高細胞內TGF-βmRNA表達的作用明顯,差異有顯著性(P0.05),上調TGF-βmRNA表達的作用高劑量中劑量低劑量,且各劑量組之間比較,差異有顯著性(P0.05);高劑量組與阿侖組對比,差異無顯著性(P0.05),高劑量組與鹽酸組對比在OA組及OA+OP組中差異無顯著性(P0.05),但在OP組中差異有顯著性(t=2.455,p=0.0490.05),高劑量組與鹽+阿組對比,在OA組及OP組中差異無顯著性(P0.05),但在OA+OP組中差異有顯著性(t=-5.526,p=0.0010.05)。由此可知高劑量組上調軟骨細胞中TGF-βmRNA的作用與鹽酸組、阿侖組、鹽+阿組大體相當。4.Western-blot結果顯示:中、高劑量組有下調細胞中NF-kbp65蛋白的作用,與正常組對比差異有顯著性(PO.05),其中以高劑量組作用最為明顯,與低、中劑量組對比差異有顯著性(P0.05);高劑量組下調NF-kbp65蛋白表達的作用較阿侖組及鹽酸組明顯,差異有顯著性(P0.05);高劑量組與鹽+阿組在OP組對比差異有顯著性(t=7.597,p=0.0020.05),但在OA組及OA+OP組中則差異無顯著性(P0.05),由此可知高劑量組下調NF-kb p65蛋白表達的作用優(yōu)于阿侖組及鹽酸組,與鹽+阿組大體相當。結論:1、A、B、C三組動物模型中均能成功提取出軟骨細胞,C組與A組比較軟骨細胞分泌蛋白多糖及Ⅱ型膠原酶的能力下降。2、補腎活血湯有促軟骨細胞增殖的作用,且呈現劑量-時間-效益關系,以高劑量補腎活血湯組作用最明顯。3、補腎活血湯、阿侖磷酸鈉、鹽酸氨基葡萄糖、鹽酸+阿侖均有促進軟骨細胞增殖的作用,其機制可能與其提高軟骨細胞內IGF-1、TGF-βmRNA表達,下調IL-1、IL-6mRNA表達及NF-kbp65蛋白表達有關,從而間接或直接起到保護或修復軟骨細胞的作用。
【圖文】：

圖３培養(yǎng)５天的原代軟骨細胞，鏡下見細胞呈多角形或梭形（２０００逡逑２．２軟骨細胞鑒定逡逑２．２．１甲苯胺藍染色逡逑由圖４－圖１２可知軟骨細胞甲苯胺藍染色，細胞質呈淡藍色，細胞

圖３培養(yǎng)５天的原代軟骨細胞，鏡下見細胞呈多角形或梭形（２０００逡逑２．２軟骨細胞鑒定逡逑２．２．１甲苯胺藍染色逡逑由圖４－圖１２可知軟骨細胞甲苯胺藍染色，細胞質呈淡藍色，，細胞
【學位授予單位】：貴陽中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2680531