【摘要】：頭頂一顆珠為百合科(Liliaceae)延齡草屬植物延齡草Trililmu tschonoskii Maxim.的干燥根及根莖。本課題采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技術(shù)對(duì)頭頂一顆珠中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,建立了藥材中3個(gè)主要皂苷類成分的HPLC含量測(cè)定方法;通過(guò)提取分離制備了頭頂一顆珠甾體皂苷,并對(duì)其中的主要皂苷類成分進(jìn)行了化學(xué)分離和結(jié)構(gòu)鑒定;在化學(xué)研究的基礎(chǔ)上,利用神經(jīng)行為學(xué)、核磁共振成像、組織病理學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)研究頭頂一顆珠甾體皂苷抗腦缺血藥理作用,并從Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)探討其分子機(jī)制。主要包括兩個(gè)部分的研究:第一部分:頭頂一顆珠化學(xué)研究目的:定性和定量分析頭頂一顆珠藥材中的主要甾體皂苷類成分;制備頭頂一顆珠甾體皂苷,分離、鑒定其中的主要成分。方法:采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技術(shù)快速指認(rèn)頭頂一顆珠藥材中的甾體皂苷類成分;采用HPLC-DAD技術(shù)建立藥材中重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ和偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)3個(gè)皂苷類成分的含量測(cè)定方法:Angilent Poroshell C18 色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 m),乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫,流速1.0mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。采用700%乙醇回流、正丁醇萃取和D101大孔樹(shù)脂純化,制備頭頂一顆珠甾體皂苷,通過(guò)硅膠柱色譜對(duì)甾體皂苷進(jìn)行化學(xué)分離,根據(jù)波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu);應(yīng)用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù),通過(guò)對(duì)照品比對(duì)和化合物裂解規(guī)律指認(rèn)頭頂一顆珠甾體皂苷中的主要成分。結(jié)果:指認(rèn)了頭頂一顆珠藥材中的27個(gè)化學(xué)成分,其中23個(gè)為甾體皂苷類成分;含量測(cè)定結(jié)果表明,重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ和PRRG色譜峰分離度良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)相關(guān)性符合要求(r≥0.9997),平均加樣回收率為97%～103%,RSD值為0.5700～3.61%,對(duì)11批頭頂一顆珠藥材的含量測(cè)定結(jié)果顯示,3種成分在各批次藥材中有較大差異。從藥材中分離、富集了頭頂一顆珠甾體皂苷,分離、鑒定了其中的4個(gè)單體成分,分別為重樓皂苷Ⅵ,重樓皂苷Ⅶ,偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1 →4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)和偏諾皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖苷。高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析表明,頭頂一顆珠甾體皂苷中主要含有7個(gè)皂苷類成分,分別為:重樓皂苷Ⅶ(1)、PRRG(2)、重樓皂苷Ⅵ(3)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(4)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(5)、偏諾皂苷元-3-0-β-D-葡萄糖苷(6)和重樓皂苷V(7)。結(jié)論:通過(guò)定性分析,明確了頭頂一顆珠藥材中主要含有甾體皂苷類成分;所建立的HPLC含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠,可用于該藥材和提取物的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)制備的頭頂一顆珠甾體皂苷主要含有7個(gè)甾體皂苷類成分,包括6個(gè)偏諾皂苷類化合物和1個(gè)薯蕷皂苷類化合物;該部分實(shí)驗(yàn)為頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量控制和藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分:頭頂一顆珠抗腦缺血藥理研究目的:觀察頭頂一顆珠甾體皂苷對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)以及腦組織神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的影響,并進(jìn)一步從Wnt/β-Catenin信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)探討頭頂一顆珠甾體皂苷抗腦缺血作用的分子機(jī)制。方法:采用中動(dòng)脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)方法制備大鼠局灶性腦缺血模型。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、頭頂一顆珠甾體皂苷(TSTT)三個(gè)劑量組(130、65、33mg/kg)以及陽(yáng)性藥金納多60mg/kg組。各給藥組大鼠于腦缺血手術(shù)后6小時(shí)灌胃給藥,假手術(shù)組、模型組灌胃給予等容量生理鹽水,每天灌胃1次,連續(xù)給藥15天進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。Bederson評(píng)分法及橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肢體運(yùn)動(dòng)功能的缺損。T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging,T2WI)結(jié)合T2WI圖像檢測(cè)腦缺血大鼠腦梗死體積;T2 mapping成像獲取T2弛豫時(shí)間,定量分析腦缺血大鼠不同腦區(qū)的損傷;三維時(shí)間飛躍(Three dimensional time of flight,3D-TOF)磁共振血管成像(Magnetic resonance angiography,MRA)觀察腦缺血后中動(dòng)脈閉塞情況.,定量分析血管信號(hào)強(qiáng)度;三維動(dòng)脈自旋標(biāo)記技術(shù)(Three dimensional arterial spin labeling,3D-ASL)檢測(cè)腦血流量(Cerebralblood flow,CBF)變化。HE染色觀察腦缺血大鼠病理學(xué)損傷;免疫組化染色結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測(cè)軸突損傷標(biāo)記蛋白APP的表達(dá);免疫熒光染色結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測(cè)新生細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67、新生神經(jīng)元遷移的標(biāo)記蛋白DCX的表達(dá);免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)檢測(cè)GFAP+/Ki67+、NeuN+/Ki67+陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞,分析新生細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分化,綜合評(píng)價(jià)頭頂一顆珠甾體皂苷對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)病理?yè)p傷及新生細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響。透射電鏡觀察缺血梗死灶周圍皮層組織神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管、軸索髓鞘、突觸以及線粒體的超微結(jié)構(gòu),評(píng)價(jià)頭頂一顆珠甾體皂苷對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。RT-PCR技術(shù)定量分析腦缺血15天大鼠皮層Wnt3a、β-catenin、GSK-3α、GSK-3ββ、Dishevelled 3 和 CRMP 2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá);Western Blot 技術(shù)定量分析 W nt3a、Dishevelled 3、β-catenin 及 P-β-catenin Ser33/37Thr41、GSK-3α及 P-GSK3α Se r21/Tyr279、GSK-3β及 P-GSK3ββ Ser9/Tyr216 和 CRMP 2 及 P-CRMP2 Thr514 的蛋白表達(dá),分析頭頂一顆珠甾體皂苷對(duì)Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵信號(hào)分子的調(diào)控作用。結(jié)果:Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可提高局灶性腦缺血15天大鼠存活率(P0.05)。和模型組相比,TSTT 65 mg/kg可明顯改善腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)缺損癥狀(P0.01或P0.05),降低腦缺血梗死體積(P0.01),減輕缺血腦區(qū)頂葉皮層、紋狀體rT2值(0.05),增強(qiáng)基底動(dòng)脈及右側(cè)前動(dòng)脈血管信號(hào)強(qiáng)度(P0.05),提高頂葉皮層、紋狀體rCBF(P0.01或P0.05)。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元變性程度;下調(diào)灰質(zhì)腦區(qū)皮層、丘腦、紋狀體及白質(zhì)腦區(qū)外囊、內(nèi)囊等部位APP表達(dá);上調(diào)DCX蛋白在紋狀體表達(dá),增加缺血腦區(qū)側(cè)腦室及紋狀體Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);差異較模型組具有顯著性(P0.01或P0.05)。透射電鏡觀察結(jié)果顯示:和模型組相比,TSTT130、65、33mg/kg給藥可不同程度減輕腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)損傷;降低軸突與髓鞘外徑/內(nèi)徑比值(P0.01);增加皮層突觸數(shù)量,提高PSD厚度,減小突觸間隙(P0.01),降低線粒體損傷評(píng)分(P0.01);TSTT 130、65 mg/kg還能增加PSD長(zhǎng)度,與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。Wnt/β-Catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子檢測(cè)結(jié)果顯示:TSTT 65 mg/kg組大鼠Wnt3a mRNA、蛋白表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(P0.01或P0.05);TSTT33 mg/kg也可明顯增加局灶性腦缺血大鼠Wnt3a蛋白表達(dá)(P0.05),與模型組比較差異明顯。β-c.atenin結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可明顯上調(diào)中動(dòng)脈栓塞大鼠β-catenin mRNA,總蛋白表達(dá)及下調(diào)P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白表達(dá);TSTT 130 mg/kg可上調(diào)β-catenin mRNA 表達(dá)、TSTT 130、33 mg/kg 可下調(diào) P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白的表達(dá),差異較模型組具有顯著性(P0.05)。Dishevelled 3檢測(cè)結(jié)果顯示,TSTT 65、33 mg/kg 可明顯上調(diào) Dishevelled 3 mRNA、蛋白表達(dá);TSTT 130 mg/kg也可提高Dishevelled 3蛋白表達(dá),差異較模型組顯著(P0.01或P0.05)。GSK-3 結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg 可明顯下調(diào) GSK-3α mRNA 和 GSK-3ββ mRNA表達(dá),上調(diào) P-GSK3α/ββ Ser21/9 蛋白的表達(dá);TSTT 130、33 mg/kg 可降低 GSK-3ββmRNA表達(dá),與模型組比較差異明顯(P0.01或P0.05)。CRMP2 結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg 可上調(diào) CRMP2 mRNA 表達(dá);TSTT 65、33 mg/kg 可上調(diào) CRMP2 蛋白,下調(diào) P-CRMP2 Thr514 蛋白表達(dá);TSTT 130 mg/kg可下調(diào)P-CRMP2 Thr514蛋白表達(dá),差異較模型組具有顯著性(P0.01或P0.05)。結(jié)論:頭頂一顆珠甾體皂苷可減輕中動(dòng)脈栓塞致局灶性腦缺血大鼠組織損傷;改善神經(jīng)病理學(xué)及神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)改變;增加缺血腦區(qū)血流灌注;并通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄及翻譯促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生,促進(jìn)神經(jīng)功能的重塑。
【圖文】：

首都醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文]+，分子式：C33H52O9；該化合物的1H-NMR(C5D5N有四個(gè)甲基信號(hào)δ：0.91(3H, s, CH3-18)、0.69(3H, dH, s, CH3-19）、1.25(3H, s, CH3-21)，在低場(chǎng)區(qū)可見(jiàn)烯 H-6)；5.07(1H, d, J=7.5Hz, Glc-H-1)為葡萄糖的端基D5N, 125 MHz)譜中，高場(chǎng)區(qū)有四個(gè)甲基碳信號(hào)：δ17.3(C-27)、δ19.5(C-19)，δ109.9(C-22)為甾體皂苷的)，δ28.8(C-24)，δ66.7(C-26)，δ17.3(C-27)信號(hào)表明δ140.9(C-5)和δ121.8(C-6)為烯雙鍵碳信號(hào)，δ90.1 諾皂苷類化合物；δ78.5 說(shuō)明 C-3 位成苷；δ102.6 是62.9 是葡萄糖 6 位連氧亞甲基信號(hào)，該化合物的核磁本一致，鑒定為偏諾皂苷元-3-O- -D-葡萄吡喃糖苷。1H-NMR 和13C-NMR 見(jiàn)附圖 3 和附圖 4。

圖 5 Kaplan-Meier 生存分析和生存曲線Sham (假手術(shù)); Model (模型); TSTT (頭頂一顆珠甾體皂苷); Ginaton(金納多)與模型組相比：*P < 0.05, **P < 0.012 頭頂一顆珠甾體皂苷對(duì)腦缺血大鼠體重的影響造模前各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組大鼠體重于造模后 1 天開(kāi)始下降，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，體重逐漸恢復(fù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：TSTT 65 mg/kg 組大鼠造模后第 1，，3，4，9，13，15 天體重明顯高于模型組(P < 0.05 或 P < 0.01)；TSTT 130、33 mg/kg 劑量組大鼠造模后第 9、13 天體重較模型組明顯升高(P <0.05)。陽(yáng)性藥金納多劑量組大鼠體重于造模后第 2-15 天的體重與模型組比較具顯著性差異(P < 0.05, P < 0.01)。（見(jiàn)表 10）表 10 TSTT 對(duì)腦缺血大鼠體重的影響( x ±S, n=8~10)劑量day0 day1 day3 day4 day9 day13
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677068