【摘要】：頭頂一顆珠為百合科(Liliaceae)延齡草屬植物延齡草Trililmu tschonoskii Maxim.的干燥根及根莖。本課題采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技術(shù)對頭頂一顆珠中的化學成分進行定性分析,建立了藥材中3個主要皂苷類成分的HPLC含量測定方法;通過提取分離制備了頭頂一顆珠甾體皂苷,并對其中的主要皂苷類成分進行了化學分離和結(jié)構(gòu)鑒定;在化學研究的基礎(chǔ)上,利用神經(jīng)行為學、核磁共振成像、組織病理學及分子生物學技術(shù)研究頭頂一顆珠甾體皂苷抗腦缺血藥理作用,并從Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子的表達探討其分子機制。主要包括兩個部分的研究:第一部分:頭頂一顆珠化學研究目的:定性和定量分析頭頂一顆珠藥材中的主要甾體皂苷類成分;制備頭頂一顆珠甾體皂苷,分離、鑒定其中的主要成分。方法:采用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技術(shù)快速指認頭頂一顆珠藥材中的甾體皂苷類成分;采用HPLC-DAD技術(shù)建立藥材中重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ和偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)3個皂苷類成分的含量測定方法:Angilent Poroshell C18 色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 m),乙腈-水為流動相梯度洗脫,流速1.0mL·min-1,柱溫30℃,檢測波長203nm。采用700%乙醇回流、正丁醇萃取和D101大孔樹脂純化,制備頭頂一顆珠甾體皂苷,通過硅膠柱色譜對甾體皂苷進行化學分離,根據(jù)波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu);應用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù),通過對照品比對和化合物裂解規(guī)律指認頭頂一顆珠甾體皂苷中的主要成分。結(jié)果:指認了頭頂一顆珠藥材中的27個化學成分,其中23個為甾體皂苷類成分;含量測定結(jié)果表明,重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ和PRRG色譜峰分離度良好,標準曲線在線性范圍內(nèi)相關(guān)性符合要求(r≥0.9997),平均加樣回收率為97%～103%,RSD值為0.5700～3.61%,對11批頭頂一顆珠藥材的含量測定結(jié)果顯示,3種成分在各批次藥材中有較大差異。從藥材中分離、富集了頭頂一顆珠甾體皂苷,分離、鑒定了其中的4個單體成分,分別為重樓皂苷Ⅵ,重樓皂苷Ⅶ,偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1 →4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(PRRG)和偏諾皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖苷。高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析表明,頭頂一顆珠甾體皂苷中主要含有7個皂苷類成分,分別為:重樓皂苷Ⅶ(1)、PRRG(2)、重樓皂苷Ⅵ(3)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(4)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-O-β-D-葡萄糖苷(5)、偏諾皂苷元-3-0-β-D-葡萄糖苷(6)和重樓皂苷V(7)。結(jié)論:通過定性分析,明確了頭頂一顆珠藥材中主要含有甾體皂苷類成分;所建立的HPLC含量測定方法簡便、穩(wěn)定、可靠,可用于該藥材和提取物的質(zhì)量控制。實驗制備的頭頂一顆珠甾體皂苷主要含有7個甾體皂苷類成分,包括6個偏諾皂苷類化合物和1個薯蕷皂苷類化合物;該部分實驗為頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量控制和藥效學研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分:頭頂一顆珠抗腦缺血藥理研究目的:觀察頭頂一顆珠甾體皂苷對中動脈栓塞大鼠神經(jīng)行為學、神經(jīng)病理學以及腦組織神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的影響,并進一步從Wnt/β-Catenin信號通路關(guān)鍵信號分子的表達探討頭頂一顆珠甾體皂苷抗腦缺血作用的分子機制。方法:采用中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)方法制備大鼠局灶性腦缺血模型。SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、頭頂一顆珠甾體皂苷(TSTT)三個劑量組(130、65、33mg/kg)以及陽性藥金納多60mg/kg組。各給藥組大鼠于腦缺血手術(shù)后6小時灌胃給藥,假手術(shù)組、模型組灌胃給予等容量生理鹽水,每天灌胃1次,連續(xù)給藥15天進行指標檢測。Bederson評分法及橫木行走實驗評價肢體運動功能的缺損。T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging,T2WI)結(jié)合T2WI圖像檢測腦缺血大鼠腦梗死體積;T2 mapping成像獲取T2弛豫時間,定量分析腦缺血大鼠不同腦區(qū)的損傷;三維時間飛躍(Three dimensional time of flight,3D-TOF)磁共振血管成像(Magnetic resonance angiography,MRA)觀察腦缺血后中動脈閉塞情況.,定量分析血管信號強度;三維動脈自旋標記技術(shù)(Three dimensional arterial spin labeling,3D-ASL)檢測腦血流量(Cerebralblood flow,CBF)變化。HE染色觀察腦缺血大鼠病理學損傷;免疫組化染色結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測軸突損傷標記蛋白APP的表達;免疫熒光染色結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測新生細胞增殖標記蛋白Ki67、新生神經(jīng)元遷移的標記蛋白DCX的表達;免疫熒光雙標染色技術(shù)檢測GFAP+/Ki67+、NeuN+/Ki67+陽性神經(jīng)細胞,分析新生細胞向星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的分化,綜合評價頭頂一顆珠甾體皂苷對腦缺血大鼠神經(jīng)病理損傷及新生細胞增殖、遷移、分化的影響。透射電鏡觀察缺血梗死灶周圍皮層組織神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、血管、軸索髓鞘、突觸以及線粒體的超微結(jié)構(gòu),評價頭頂一顆珠甾體皂苷對腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的保護作用。RT-PCR技術(shù)定量分析腦缺血15天大鼠皮層Wnt3a、β-catenin、GSK-3α、GSK-3ββ、Dishevelled 3 和 CRMP 2 的轉(zhuǎn)錄表達;Western Blot 技術(shù)定量分析 W nt3a、Dishevelled 3、β-catenin 及 P-β-catenin Ser33/37Thr41、GSK-3α及 P-GSK3α Se r21/Tyr279、GSK-3β及 P-GSK3ββ Ser9/Tyr216 和 CRMP 2 及 P-CRMP2 Thr514 的蛋白表達,分析頭頂一顆珠甾體皂苷對Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵信號分子的調(diào)控作用。結(jié)果:Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可提高局灶性腦缺血15天大鼠存活率(P0.05)。和模型組相比,TSTT 65 mg/kg可明顯改善腦缺血大鼠神經(jīng)行為學缺損癥狀(P0.01或P0.05),降低腦缺血梗死體積(P0.01),減輕缺血腦區(qū)頂葉皮層、紋狀體rT2值(0.05),增強基底動脈及右側(cè)前動脈血管信號強度(P0.05),提高頂葉皮層、紋狀體rCBF(P0.01或P0.05)。病理學檢測結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元變性程度;下調(diào)灰質(zhì)腦區(qū)皮層、丘腦、紋狀體及白質(zhì)腦區(qū)外囊、內(nèi)囊等部位APP表達;上調(diào)DCX蛋白在紋狀體表達,增加缺血腦區(qū)側(cè)腦室及紋狀體Ki67陽性細胞數(shù);差異較模型組具有顯著性(P0.01或P0.05)。透射電鏡觀察結(jié)果顯示:和模型組相比,TSTT130、65、33mg/kg給藥可不同程度減輕腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)損傷;降低軸突與髓鞘外徑/內(nèi)徑比值(P0.01);增加皮層突觸數(shù)量,提高PSD厚度,減小突觸間隙(P0.01),降低線粒體損傷評分(P0.01);TSTT 130、65 mg/kg還能增加PSD長度,與模型組比較均具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。Wnt/β-Catenin信號通路關(guān)鍵分子檢測結(jié)果顯示:TSTT 65 mg/kg組大鼠Wnt3a mRNA、蛋白表達較模型組明顯上調(diào)(P0.01或P0.05);TSTT33 mg/kg也可明顯增加局灶性腦缺血大鼠Wnt3a蛋白表達(P0.05),與模型組比較差異明顯。β-c.atenin結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg可明顯上調(diào)中動脈栓塞大鼠β-catenin mRNA,總蛋白表達及下調(diào)P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白表達;TSTT 130 mg/kg可上調(diào)β-catenin mRNA 表達、TSTT 130、33 mg/kg 可下調(diào) P-β-catenin Ser33/37Thr41蛋白的表達,差異較模型組具有顯著性(P0.05)。Dishevelled 3檢測結(jié)果顯示,TSTT 65、33 mg/kg 可明顯上調(diào) Dishevelled 3 mRNA、蛋白表達;TSTT 130 mg/kg也可提高Dishevelled 3蛋白表達,差異較模型組顯著(P0.01或P0.05)。GSK-3 結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg 可明顯下調(diào) GSK-3α mRNA 和 GSK-3ββ mRNA表達,上調(diào) P-GSK3α/ββ Ser21/9 蛋白的表達;TSTT 130、33 mg/kg 可降低 GSK-3ββmRNA表達,與模型組比較差異明顯(P0.01或P0.05)。CRMP2 結(jié)果顯示,TSTT 65 mg/kg 可上調(diào) CRMP2 mRNA 表達;TSTT 65、33 mg/kg 可上調(diào) CRMP2 蛋白,下調(diào) P-CRMP2 Thr514 蛋白表達;TSTT 130 mg/kg可下調(diào)P-CRMP2 Thr514蛋白表達,差異較模型組具有顯著性(P0.01或P0.05)。結(jié)論:頭頂一顆珠甾體皂苷可減輕中動脈栓塞致局灶性腦缺血大鼠組織損傷;改善神經(jīng)病理學及神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)改變;增加缺血腦區(qū)血流灌注;并通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵信號分子的轉(zhuǎn)錄及翻譯促進腦缺血后神經(jīng)發(fā)生,促進神經(jīng)功能的重塑。
【圖文】：

首都醫(yī)科大學碩士學位論文]+，分子式：C33H52O9；該化合物的1H-NMR(C5D5N有四個甲基信號δ：0.91(3H, s, CH3-18)、0.69(3H, dH, s, CH3-19）、1.25(3H, s, CH3-21)，在低場區(qū)可見烯 H-6)；5.07(1H, d, J=7.5Hz, Glc-H-1)為葡萄糖的端基D5N, 125 MHz)譜中，高場區(qū)有四個甲基碳信號：δ17.3(C-27)、δ19.5(C-19)，δ109.9(C-22)為甾體皂苷的)，δ28.8(C-24)，δ66.7(C-26)，δ17.3(C-27)信號表明δ140.9(C-5)和δ121.8(C-6)為烯雙鍵碳信號，δ90.1 諾皂苷類化合物；δ78.5 說明 C-3 位成苷；δ102.6 是62.9 是葡萄糖 6 位連氧亞甲基信號，該化合物的核磁本一致，鑒定為偏諾皂苷元-3-O- -D-葡萄吡喃糖苷。1H-NMR 和13C-NMR 見附圖 3 和附圖 4。

圖 5 Kaplan-Meier 生存分析和生存曲線Sham (假手術(shù)); Model (模型); TSTT (頭頂一顆珠甾體皂苷); Ginaton(金納多)與模型組相比：*P < 0.05, **P < 0.012 頭頂一顆珠甾體皂苷對腦缺血大鼠體重的影響造模前各組大鼠體重無統(tǒng)計學差異。各組大鼠體重于造模后 1 天開始下降，隨著缺血時間的延長，體重逐漸恢復。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示：TSTT 65 mg/kg 組大鼠造模后第 1，，3，4，9，13，15 天體重明顯高于模型組(P < 0.05 或 P < 0.01)；TSTT 130、33 mg/kg 劑量組大鼠造模后第 9、13 天體重較模型組明顯升高(P <0.05)。陽性藥金納多劑量組大鼠體重于造模后第 2-15 天的體重與模型組比較具顯著性差異(P < 0.05, P < 0.01)。（見表 10）表 10 TSTT 對腦缺血大鼠體重的影響( x ±S, n=8~10)劑量day0 day1 day3 day4 day9 day13
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

【參考文獻】

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本文編號：2677068