【摘要】：蓓蕾藍靛果(Lonicera caerulea 'Beilei')是我國審定的第一個藍靛果品種,也是目前東北地區(qū)主要栽培品種,栽培面積逐年增加,但是其果實加工利用、生理功能等基礎理論和技術方面研究相對滯后,制約了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度和水平。蓓蕾藍靛果富含花色苷類物質(zhì),該類物質(zhì)已被證實具有抗細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等功能。近年來,從植物源中分離提取花色苷類物質(zhì),研究其生理活性并加以利用,已成為植物資源開發(fā)利用領域研究的熱點。本論文以蓓蕾藍靛果為材料,開展其花色苷的分離提取及抗腫瘤活性研究。采用響應面法優(yōu)化超聲輔助逆流提取蓓蕾藍靛果花色苷工藝參數(shù),通過介質(zhì)篩選,研究蓓蕾藍靛果花色苷分離純化方法,并從體外細胞、體內(nèi)動物模型兩個層面系統(tǒng)研究蓓蕾花色苷的抗腫瘤效果和相關機制。研究結果可為蓓蕾藍靛果資源的深入開發(fā)利用提供理論基礎和技術參考。主要研究結果如下:(1)建立了蓓蕾藍靛果花色苷的超聲逆流提取工藝,最佳工藝參數(shù)為:三級逆流提取,溶劑為70%(v/v)乙醇水溶液,固-液比1:10(g/ml),超聲時間28min,超聲溫度30℃,超聲功率120W,蓓蕾花色苷得率為5.22%。在最佳工藝條件下,與超聲波法比較(89.86%),該工藝提取率提高了 10%。(2)從靜態(tài)吸附、靜態(tài)解析和動態(tài)流動洗脫三個方面比較不同分離介質(zhì)的分離純化效果,篩選出了適宜于藍靛果花色苷分離制備的新型樹脂XDA-6。采用該樹脂分離純化蓓蕾藍靛果花色苷,得到純度20%以上的花色苷組分4個:B1(25.35±0.23%)、B2(42.91 ±0.32%)、B3(31.12±0.32%)、B4(24.87±0.26%),其中 B2 組分(純度為42.91 ±0.32%)與以往采用X-5樹脂制備的藍靛果花色苷(純度為34.85%)比較,純度提高了 8.06%。(3)四個蓓蕾花色苷組分(B1-B4,純度高于20%的)抗SMMC-7721細胞增殖效果最佳,且對正常細胞293T無細胞毒性,但它們抗MCF-7細胞增殖作用不明顯;四個分離組分中,B2組分抗SMMC-7221細胞增殖效果最好(IC50值為0.123mg/mL)。根據(jù)流式細胞術,熒光顯色和電鏡觀測結果,蓓蕾花色苷B2組分不但具有抗SMMC-7721細胞增殖活性,而且具有誘導SMMC-7721細胞凋亡(細胞凋亡率為66.32±1.05%)的作用,其作用機制是:B2組分可以把細胞周期阻滯在G2/M期,DNA受到損傷,減少有絲分裂,從而導致細胞凋亡。(4)蓓蕾花色苷B2組分各劑量組對H22荷瘤小鼠均有抗腫瘤作用,其中高劑量組的抗腫瘤作用最佳,抑瘤率達到46.30±2.20%,而且可以明顯改善H22荷瘤小鼠的生存狀態(tài)和免疫器官機能。其抗腫瘤活性機制:通過提高小鼠機體內(nèi)SOD、GSH-Px的酶活,降低脂質(zhì)過氧化水平,提高抗氧化能力;通過調(diào)節(jié)免疫細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平,尤其是肝臟中IL-2和TNF-α的水平,提高免疫活性,直接殺傷腫瘤細胞。(5)抗腫瘤活性最強的蓓蕾花色苷組分B2的主要花色苷類型為矢車菊-3-葡萄糖苷,其含量為42.91±0.32%。
【圖文】：

圖２－１四級逆流提取原理示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ－ｓｔａｇｅ邋ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑

逡逑由圖２－３多重比較結果可見，固－液比為１：．５時，提取效率最低，與其他組存在顯著逡逑性差異（ＰＣ０．０５），這是因為溶液體積少，很容易達到飽和，使目標產(chǎn)物花色苷不能逡逑充分溶出，固－液比從１：１０增加到１：３０時，隨著溶劑量的增加，蓓蕾藍靛果花色苷的得逡逑率逐漸增大，固－液比由１：１０增加到１：１５時，兩者之間沒有顯著性（Ｐ＞０．０５）差異，花逡逑色苷的得率僅增加了邋２．５０％，從經(jīng)濟成本及后續(xù)濃縮處理等角度考慮，確定固－液比單因逡逑素的條件為１：１０。逡逑２．４．１．３提取溫度對蓓蕾藍靛果花色苷得率的影響逡逑一般情況下，物質(zhì)＆是隨著溫度的升高溶解度升高。天然產(chǎn)物的提取，，根據(jù)目標產(chǎn)逡逑物和提取溶劑的性質(zhì)不同，其提取所需要的溫度也不同。提取溫度對花色苷得率的影響逡逑方差分析結果見表２－１，多重比較結果見圖２－４。逡逑４．５「邋ｅ逡逑ｄ邐ｄ逡逑＾邋４．０邐－逡逑％邐N邐ｂ逡逑Ｅ邋３．Ｓ邐－邐ｒ－．－：
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

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