【摘要】：研究背景與目的:癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病之一,其致病因素復(fù)雜、發(fā)病率和死亡率高�；熑允悄壳芭R床治療惡性腫瘤的主要手段之一。常規(guī)的化療藥大多存在靶向性差、毒副作用大、生物利用度低和耐藥性的缺陷,從而導(dǎo)致臨床療效不佳且患者生存質(zhì)量差。因此尋找新型靶向抗腫瘤藥物具有非常大的臨床價值和意義。喜樹堿是一種從中藥喜樹中分離得到的天然抗腫瘤生物堿,其在體內(nèi)外對胃癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果,以喜樹堿為母體開發(fā)了多種臨床應(yīng)用廣泛的廣譜抗癌藥物,但該類藥物靶向性差,在臨床上常引起嘔吐、腹瀉、骨髓抑制以及出血性膀胱炎等一系列毒副反應(yīng),此外該類藥物還存在水溶性差和穩(wěn)定性差的缺陷。前列腺膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)是位于前列腺上皮細(xì)胞表面的Ⅱ型跨膜糖蛋白。研究表明其在前列腺組織和多種非前列腺實(shí)體瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá),在正常組織中不表達(dá)。此外PSMA還具有葉酸水解酶(FOLH)、谷氨酸竣肽酶Ⅱ(GCPⅡ)及N-乙�；�-連接的酸性二肽酶(NAALA-Dase)等多種蛋白酶的活性,PSMA是目前腫瘤診斷和腫瘤抗血管治療的良好靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。本研究在前藥原理的指導(dǎo)下,首次以PSMA的特異性水解寡肽底物作為腫瘤靶向配體,設(shè)計(jì)并合成一系列腫瘤靶向喜樹堿前藥;利用體外腫瘤細(xì)胞模型、重組人PSMA和體內(nèi)裸鼠移植瘤模型,系統(tǒng)地評價前藥的體內(nèi)外抗腫瘤活性、靶向性和毒性,以期獲得高效、低毒、靶向性強(qiáng)、作用機(jī)制明確且有臨床應(yīng)用前景的新型喜樹堿先導(dǎo)化合物,同時為其它細(xì)胞毒類藥物的二次開發(fā)提供一個新的思路。研究內(nèi)容:本研究在前藥原理指導(dǎo)下,以PSMA的特異性水解底物Asp-Glua*Glu*Glu*Glu(WT-H)、Asp-Glu*Glu*Asp-Glu(HT-H)和Glu*Glu*Glu*Asp-Glu(HT-J)(“*”表示γ-谷�；B接;“-”表示α-谷�；B接)作為腫瘤靶向配體,將其與喜樹堿20位羥基通過不同的連接片段連接,設(shè)計(jì)并合成12種全新的水溶性腫瘤靶向喜樹堿前藥CPT-X;同時為了更好地研究前藥的PSMA靶向性,我們合成8種前藥CPT-X的PSMA代謝產(chǎn)物CPT-MX;采用PSMA過表達(dá)的人前列腺癌LNCaP-FGC(PSMA+)細(xì)胞和多種PSMA陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(MCF-7、HepG2、Hela、PC-3和DU145)和人正常肝細(xì)胞(L02)評價CPT-X和CPT-MX的細(xì)胞毒活性和PSMA靶向性;采用流式細(xì)胞分析和激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證前藥CPT-W12的細(xì)胞毒選擇性和PSMA靶向性;利用重組人PSMA和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7裸鼠移植瘤模型,采用高效液相色譜法和小動物活體成像系統(tǒng),評價前藥CPT-W12的體外靶向釋放和體內(nèi)靶向分布特性;采用BALB/c小鼠評價前藥CPT-W12在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特性;采用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7裸鼠移植瘤模型評價前藥CPT-W12的體內(nèi)抗腫瘤活性和安全性;采用免疫組化研究前藥CPT-W12對腫瘤組織中Ki-67、Caspase-3、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)情況的影響,探討其可能的抗腫瘤作用機(jī)制。研究結(jié)果:(1)成功設(shè)計(jì)并合成了 12種全新的水溶性腫瘤靶向喜樹堿前藥CPT-X和8種PSMA水解產(chǎn)物CPT-MX。(2)體外細(xì)胞毒活性和PSMA靶向性研究表明前藥CPT-X對各種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的增殖抑制活性,但活性顯著低于原藥CPT;大部分前藥CPT-X對PSMA過表達(dá)的人前列腺癌細(xì)胞LNCaP-FGC的增殖抑制活性顯著強(qiáng)于PSMA陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞MCF-7、PC-3、DU145、HepG2和Hela,同時對人正常肝細(xì)胞LO2毒性較低,表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒選擇性和PSMA靶向性;流式細(xì)胞分析和激光共聚焦熒光觀察進(jìn)一步驗(yàn)證了前藥CPT-W12良好的細(xì)胞毒選擇性和PSMA靶向性,其能顯著誘導(dǎo)LNCaP-FGC(PSMA+)細(xì)胞凋亡,而對HepG2(PSMA-)凋亡誘導(dǎo)活性較弱;同時CPT-W12能夠有效地在LNCaP-FGC(PSMA+)細(xì)胞內(nèi)聚集,而在HepG2(PSMA-)聚集較少。(3)體內(nèi)外穩(wěn)定性、靶向性和初步藥代動力學(xué)研究表明前藥CPT-W12具有較好的PSMA敏感性和緩沖鹽穩(wěn)定性,其能被rh PSMA特異性水解;CPT-W12還具有良好的體內(nèi)靶向性,其能有效地在腫瘤部位聚集和滯留;與喜樹堿相比,其體內(nèi)半衰期顯著延長。(4)體內(nèi)抗腫瘤活性評價表明前藥CPT-W12對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用;低劑量CPT-W12(110mg·kg-1)、中劑量CPT-W12(30mg·kg-1)和高劑量CPT-W12(60mg·kg-1)組腫瘤抑制率分別為51.67%、57.78%和65.00%,中劑量CPT-W12組抑瘤率和陽性藥伊立替康組(10mg·kg-1)相當(dāng),高劑量CPT-W12組抑瘤率優(yōu)于伊立替康組。血液生化和組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)前藥CPT-W12能顯著降低喜樹堿的腎毒性,即使CPT-W12給藥劑量達(dá)到伊立替康的6倍,仍未發(fā)現(xiàn)明顯的系統(tǒng)毒性。(5)體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究表明前藥CPT-W12可以有效降低Ki-67和Bcl-2蛋白表達(dá)水平,升高Caspase-3蛋白的表達(dá)水平,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;此外CPT-W12還能通過降低MMP-2的表達(dá),抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和腫瘤血管的新生。研究結(jié)論:本論文以PSMA作為靶點(diǎn),在前藥原理的指導(dǎo)下,成功設(shè)計(jì)并合成了12種腫瘤靶向的水溶性喜樹堿前藥CPT-X;前藥CPT-X在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒選擇性、PSMA靶向性和穩(wěn)定性;同時CPT-X在體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性、腫瘤靶向性和安全性,其能有效地在腫瘤部位聚集并發(fā)揮抗腫瘤作用,其抗腫瘤活性與陽性藥伊立替康相當(dāng),但是無明顯的系統(tǒng)毒性;前藥CPT-X成功克服喜樹堿水溶性、穩(wěn)定性及靶向性差的缺陷,同時顯著延長了喜樹堿的半衰期。本研究證明了基于PSMA的腫瘤靶向前藥設(shè)計(jì)策略是有效、可行的,本研究有望為傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物的研發(fā)提供一個新思路,特別是中藥中的一些難溶性的細(xì)胞毒藥物;同時有望為臨床乳腺癌等實(shí)體瘤的治療提供一種新的分子靶向藥物。
【圖文】：

胞Ｂ１６Ｆ１０小鼠移植瘤模型顯示該前藥發(fā)揮了邋ＣＰＴ和Ａｒａ－Ｃ協(xié)同起效的作用，其抑瘤活逡逑性強(qiáng)于ＣＰＴ、Ａｒａ－Ｃ及ＣＰＴ／Ａｒａ－Ｃ。類似地，＾＾＾＾等［１９７］將喜樹堿和抗腫瘤藥物吉西逡逑他濱偶聯(lián)構(gòu)建了前藥１１７邋（結(jié)構(gòu)見圖２０，該前藥具有較強(qiáng)的水溶性、穩(wěn)定性和還原敏逡逑感性，體外細(xì)胞活性顯示其對Ｈｅｌａ和ＭＣＦ－７細(xì)胞的增殖抑制活性優(yōu)于喜樹堿和吉西他逡逑濱。此外，ＦｕｗｕＺｈａｎｇ等Ｉ１％將喜樹堿與水溶性偶氮藍(lán)染料衍生物連接合成了兩親性前逡逑藥１１８邋（結(jié)構(gòu)見圖２１），體外實(shí)驗(yàn)顯示該前藥具有ＧＳＨ敏感性，體外細(xì)胞增殖抑制活性逡逑與ＣＰＴ相當(dāng)；小鼠體內(nèi)ＰＥＴ成像顯示前藥１１８在血液中滯留時間是喜樹堿的１３０倍；逡逑且其對人結(jié)腸癌ＨＣＴ１１６移植瘤小鼠的抑瘤活性顯著強(qiáng)于ＣＰＴ，同時毒性較小。逡逑Ｈ２Ｎ邋入Ｎ邋0邐ｎｏ邐0ＴＹＶＶ＾逡逑ｎｏ２逡逑。逡逑Ｊｈ。0＝？＝０逡逑＾°ｉ（＾Ｐ0Ａｎｈ＿０＿＾＾０逡逑１１１邐ＮＣ逡逑0ｒ邐ｐ（逡逑１１２逡逑１１３邐１１５逡逑圖２０還原敏感型腫瘤靶向喜樹堿衍生物１０９－１１４結(jié)構(gòu)逡逑３０逡逑

圖２４邋ＰＳＭＡ靶向成像試劑１２５－１３０的結(jié)構(gòu)逡逑ＢａｎｄａｒｉＲＰ等［２８５］設(shè)計(jì)了胃泌素釋放肽受體（ＧＲＰｒ）和人前列腺膜抗原（ＰＳ靶向的前列腺診斷探針邋１３１邋（［ＤＵＰＡ－６－Ａｈｘ－（６４Ｃｕ－ＮＯＤＡＧＡ）－５－Ａｖａ－ＢＢＮ（７－１４）Ｎ結(jié)構(gòu)見圖２５），，實(shí)驗(yàn)表明其能與ＬＮＣａＰ邋（ＰＳＭＡ＋）和ＰＣ－３邋（ＧＲＰｒ＋）細(xì)胞特異性結(jié)時ＭｉｃｒｏＰＥＴ閃爍掃描顯示其在ＰＣ－３／ＬＮＣａＰ裸鼠移植瘤模型中能夠有效地在腫聚集。逡逑Ｈ２Ｎ邋丫邋０逡逑ＣＯＯＨ邐０邐Ｈ邋０邐0邋Ｉ邋Ｈ邋0邋Ｉ邋Ｈ邋０邐Ｈ邋０邐９ｖ逡逑Ｈ。上人七逡逑：：，ｉｎｇＭ0，ｉｆ邐＼邐＾邐ＣＲＰＫ邋＾邐（逡逑ＨＮ、ｎ邐Ｗ／邐Ｈ逡逑°ｆ－？邋Ｘ逡逑ｐ－逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284


本文編號：2676050