【摘要】：目的:觀察乳巖寧聯(lián)合依西美坦對(duì)絕經(jīng)后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率,探討乳巖寧抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制;探究乳巖寧聯(lián)合依西美坦通過(guò)PI3K-AKT通路絕經(jīng)后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠作用機(jī)制;觀察中藥復(fù)方乳巖寧聯(lián)合依西美坦對(duì)絕經(jīng)后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠m-TOR,HIF-1,LDH-A等蛋白的表達(dá),探究其代謝的調(diào)控機(jī)制。材料與方法:1.材料:細(xì)胞株:人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性BALB/C無(wú)胸腺裸鼠50只(SPF級(jí)),4~6周齡,體重20±2g中藥的制備:乳巖寧方(方中包括柴胡10g,太子參15g、黃芩15g、法半夏10g、炙甘草10g,生龍骨、生牡蠣各30g等11味中藥)購(gòu)自于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,分別加入10倍及8倍的純凈水,分別煎煮60分鐘和40分鐘,將兩份藥液合并,棄去藥渣,調(diào)整濃度至3.3 g/ml,4℃冰箱保存?zhèn)溆�。依西美�?25mg/片,溶解于蒸餾水中,調(diào)整濃度至3mg/ml備用。2.雙側(cè)卵巢切除(去勢(shì))模型的制備:取濃度為100mg/ml的10%水合氯醛,以4ml/kg的比重,以腹腔注射法向裸鼠體內(nèi)注入以麻醉裸鼠。將裸鼠俯臥于潔凈的手術(shù)臺(tái)上,四肢固定于手術(shù)臺(tái)中央,用備皮器在背部正中(肋弓下緣處)備皮,使用絡(luò)合碘消毒,用手術(shù)刀輕輕地切開(kāi)皮膚,切口處位于脊柱旁0.5cm,距肋弓下緣0.5cm處。順次用刀切開(kāi)肌肉,用剪刀剪開(kāi)腹膜。腹腔內(nèi)可見(jiàn)乳白色組織。然后將之輕輕地提出腹腔,被腹膜包裹的米粒大小粉紅色的“桑椹樣”的卵巢可以被看見(jiàn)。然后用鉗子鉗夾并結(jié)扎,分離出卵巢,分離后檢查腹腔內(nèi)有無(wú)滲血,用縫合器分層縫合皮膚,用絡(luò)合碘為切口消毒。利用上述方法切除對(duì)側(cè)卵巢,將小鼠保溫在20℃左右環(huán)境中,等待麻醉后蘇醒。術(shù)后肌肉注射青霉素(6萬(wàn)U/ml)抗炎,0.25ml/日,并用碘伏消毒切口,連續(xù)3天。自由進(jìn)食水。用標(biāo)準(zhǔn)SPF飼料,飼養(yǎng)30天,造模成功。3.MDA-MB-435細(xì)胞株乳腺癌荷瘤裸鼠移植模型的建立:用胰酶/EDTA將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-435細(xì)胞消化后,PBS液清洗2次,細(xì)胞內(nèi)加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液,然后將其吹打均勻。用0.4%臺(tái)盼藍(lán)將細(xì)胞染色,記錄活細(xì)胞數(shù)(95%),細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并使活細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10~7/ml。取去勢(shì)后的裸鼠,在其右側(cè)胸壁利用碘伏進(jìn)行消毒,利用注射器(1ml)在2只裸鼠的右側(cè)胸壁的第二乳墊處接種細(xì)胞液,細(xì)胞液濃度0.2ml/只。10天左右,可見(jiàn)接種部位乳墊處的腫瘤結(jié)節(jié),其質(zhì)地較硬,越來(lái)越大,長(zhǎng)勢(shì)迅速。當(dāng)原代腫瘤長(zhǎng)至0.8cm~3大小,利用手術(shù)的方式取下腫瘤。骨髓穿刺針將原代腫瘤移植至余48只裸鼠乳墊下:取10%水合氯醛(0.02ml/10g體重)以腹腔注射法向裸鼠體內(nèi)注入以麻醉裸鼠,在無(wú)菌的條件下取原代腫瘤組織并立即放入DMEM培養(yǎng)液中,用剪刀將其剪切成1mm~3左右的小塊,并將小塊置入骨髓穿刺針中備用。接種前,先在裸鼠的右側(cè)胸壁用碘伏進(jìn)行消毒處理,于右側(cè)胸壁第二乳墊旁開(kāi)1cm處平刺進(jìn)針,當(dāng)針進(jìn)入到乳墊下的時(shí)候,將針芯插入進(jìn)去。瘤組織隨即便留在右側(cè)胸壁的第二乳墊下,然后用碘酒將皮膚消毒,不需要縫合傷口,一次性腹腔注射青霉素注射液1.5萬(wàn)U,將裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級(jí)箱中。移植后的第四至五天后右側(cè)胸壁的第二乳墊處可見(jiàn)到有實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng),成瘤率100%,而且形狀、大小較整齊,在移植后第十五天左右腫瘤可長(zhǎng)至9±2mm。4.實(shí)驗(yàn)分組及給藥:取造模成功的50只的裸鼠中瘤體長(zhǎng)勢(shì)良好的48只并隨機(jī)分為四組:空白模型對(duì)照組,中藥組(乳巖寧組),西藥組(依西美坦組),聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)。根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式,計(jì)算各組給藥的劑量。(1)空白模型對(duì)照組:0.2ml/只/天生理鹽水灌胃(2)中藥組(乳巖寧組):乳巖寧藥液,以33.3g/kg體重給藥(相當(dāng)于臨床人用量的12倍),0.2ml/只/天灌胃(3)西藥組(依西美坦組):依西美坦按4mg/kg體重給藥(相當(dāng)于臨床人用量的10倍),0.2ml/只/天灌胃(4)結(jié)合組(乳巖寧+依西美坦),乳巖寧33.3g/kg體重+依西美坦4mg/kg體重,0.2ml/只/天灌胃,連續(xù)給藥21天。5.實(shí)驗(yàn)取材實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各組裸鼠分別進(jìn)行取材,用脫頸處死法將裸鼠處死,并置于冰盒之上。將小鼠胸部腫瘤完整的剝離下來(lái),稱(chēng)取重量并放置在冰盒之上。肉眼觀察瘤體組織形態(tài)、大小,之后將其切取成若干腫瘤全層組織,同時(shí)注意多點(diǎn)取材以避免腫瘤壞死組織,共取材2份:(1)RT-PCR標(biāo)本:2-3個(gè)大小約8 mm~3組織塊,置于1mlTrizol中,記號(hào)筆標(biāo)記后,立即置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?(2)Western Blot標(biāo)本:組織塊置于EP管中,-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?6.檢測(cè)指標(biāo):(1)21天后,利用脫頸處死法處死裸鼠后,完整剝離腫瘤稱(chēng)重,計(jì)算抑瘤率,抑瘤率公式:抑瘤率=(模型組瘤重一實(shí)驗(yàn)組瘤重)/模型組瘤重×100%;(2)抑癌作用:Western blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)瘤體中P53、caspase3的表達(dá),RT-PCR法檢測(cè)瘤體中NF-kB,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)PI3K-AKT通路:Western blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)瘤體中PI3K、AKT的表達(dá),RT-PCR法檢測(cè)瘤體中PI3K、AKT的表達(dá),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(4)代謝調(diào)控機(jī)制:Western blot蛋白免疫印跡法檢測(cè)瘤體中mTOR和HIF-1表達(dá),RT-PCR法檢測(cè)瘤體中mTOR、LDH-A、HIF-1和GLUT1的表達(dá),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.瘤重:與對(duì)照組比較,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的瘤體質(zhì)量明顯降低(P0.05),其中聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)較中藥組(乳巖寧組)和西藥組(依西美坦組)的瘤重有明顯降低(P0.05)。2.抑癌作用:Western blot:P53和caspase3:與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.05),聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)較中藥組(乳巖寧組)和西藥組(依西美坦組)有明顯升高(P0.05);RT-PCR:NF-kB基因:與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的NF-kB基因表達(dá)明顯下降(P0.05),聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的趨勢(shì)更加明顯(P0.05)。3.PI3K-AKT通路:Western blot:PI3K、AKT的蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的PI3K、AKT的蛋白表達(dá)均明顯下降(P0.05)。聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的PI3K和AKT的蛋白表達(dá)較中藥組(乳巖寧組)和西藥組(依西美坦組)有明顯下降(P0.05)。RT-PCR:PI3K、AKT基因表達(dá):與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的PI3K、AKT基因表達(dá)均明顯降低(P0.05),聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的趨勢(shì)更加明顯(P0.05)。4.代謝調(diào)控機(jī)制:Western blot:mTOR、HIF-1蛋白表達(dá),與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的mTOR、HIF-1和GLUT1蛋白表達(dá)均明顯降低(P0.05),聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的趨勢(shì)更加明顯(P0.05);mTOR、LDH-A、HIF-1和GLUT1基因表達(dá):與對(duì)照組相比,中藥組(乳巖寧組)、西藥組(依西美坦組)和聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的mTOR、LDH、HIF和GLUT1基因表達(dá)均明顯降低(P0.05)。聯(lián)合組(乳巖寧+依西美坦組)的各基因表達(dá)較中藥組(乳巖寧組)和西藥組(依西美坦組)有明顯下降,(P0.05)。結(jié)論:1.乳巖寧聯(lián)合依西美坦對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用:乳巖寧和依西美坦可通過(guò)上調(diào)P53和caspase3蛋白、下調(diào)NF-kB基因的表達(dá)對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌荷瘤裸鼠瘤體均有明顯的抑制作用,且聯(lián)合用藥作用更加明顯。2.乳巖寧聯(lián)合依西美坦對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌荷瘤裸鼠PI3K-AKT通路的影響:乳巖寧聯(lián)合依西美坦可通過(guò)下調(diào)PI3K、AKT的蛋白和基因的表達(dá)以抑制PI3K-AKT通路的活性。3.乳巖寧聯(lián)合依西美坦對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌荷瘤裸鼠代謝調(diào)控機(jī)制:乳巖寧聯(lián)合依西美坦可通過(guò)下調(diào)PI3K-AKT通路下游基因的表達(dá)以影響腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng),以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
【圖文】：

萎靡、活動(dòng)次數(shù)減少，，中藥組（乳巖寧組）上述表現(xiàn)較少。期組）和西藥組（依西美坦組）各有一只裸鼠因腫瘤消耗死實(shí)驗(yàn)結(jié)束未有裸鼠死亡。表 2 各組裸鼠瘤重比較（x±s）Table 2 Change in tumor weight of micen Body weight（g） Tumor weight（g） Tumo12 20.33±1.37 1.090±0.904* －12 20.67±0.65 0.667±0.236** 38.8011 20.45±1.29 0.675±0.202# 38.0711 20.63±1.43 0.251±0.098 76.97control vs others ** p>0.05 Ruyanning vs Exemestane group , # Exemestane vs combined

圖 3.各組 P53 和 caspase3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig3. The relative expression of P53 and caspase3 for all groups* P<0.05 control vs others ,#P<0.05 Ruyanning and Exemestane vs com3 所示：與對(duì)照組相比，中藥組（乳巖寧組）、西藥組（依西美坦組寧+依西美坦組）的 P53、caspase3 的表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（組（乳巖寧+依西美坦組）較中藥組（乳巖寧組）和西藥組（依西美顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P<0.05）。說(shuō)明乳巖寧和依西美坦均可上的蛋白表達(dá)，且聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)勢(shì)更加明顯。R 法檢測(cè) NF-kB 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李軍,郭瑞臣,王本杰;依西美坦膠囊的人體生物等效性研究[J];中國(guó)藥房;2003年10期

2 高磊,閆占軍,王偉,張麗華;依西美坦膠囊溶出度測(cè)定[J];中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn);2002年02期

3 邵穎,黎文海,尤啟冬;依西美坦的合成[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2001年08期

4 趙修南;依西美坦治療絕經(jīng)后婦女晚期乳腺癌[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2000年03期

5 趙勇;P&U公司的依西美坦在美國(guó)獲準(zhǔn)上市[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2000年03期

6 ;激素敏感性早期乳腺癌:依西美坦初始不優(yōu)于序貫[J];現(xiàn)代醫(yī)院;2010年02期

7 ;依西美坦對(duì)絕經(jīng)后婦女乳腺癌的預(yù)防作用[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

8 ;依西美坦對(duì)絕經(jīng)后婦女乳腺癌的預(yù)防作用[J];中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志;2012年12期

9 崔宇;姚嬙;;依西美坦在乳腺癌治療中的應(yīng)用[J];天津藥學(xué);2006年06期

10 劉曉晴,宋三泰,劉基巍,任軍,汪安蘭,樊青霞,王雅杰,宋恕平,謝廣茹,秦鳳展,王天峰;依西美坦治療絕經(jīng)后晚期乳腺癌的臨床研究[J];中華腫瘤雜志;2003年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前3條

1 王紹光;李繼俊;趙興波;李建峰;;芳香化酶抑制劑依西美坦對(duì)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響[A];第八次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 于世英;;2011年臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展[A];第22屆湖北省腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2012年

3 王曉稼;;從MA27研究看個(gè)體化輔助內(nèi)分泌治療[A];首屆浙贛兩省腫瘤研究交流會(huì)論文匯編[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 唐風(fēng);FDA批準(zhǔn)依西美坦用于乳癌輔助治療[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

2 張驍；束梅英;新型芳香化酶抑制劑依西美坦[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

3 本文由香港麥迪信醫(yī)學(xué)出版有限公司供稿;抗腫瘤藥物研究未來(lái)誰(shuí)領(lǐng)風(fēng)騷[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

4 編譯 伊遙;第三代芳香化酶抑制劑優(yōu)勢(shì)明顯[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2012年

5 伊遙;SERMs疲軟，AIs趕超[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 程思謨;乳巖寧聯(lián)合依西美坦通過(guò)Pi3K-Akt通路對(duì)乳腺癌荷瘤裸鼠代謝機(jī)制的研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2018年

2 邢延一;非甾體類(lèi)芳香化酶抑制劑的代謝研究及其專(zhuān)屬性指標(biāo)模型的建立[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張旭;芳香化酶抑制劑影響絕經(jīng)后激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者血脂水平的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2018年

2 徐慧婷;依西美坦的合成新工藝及其螺環(huán)衍生物的研究[D];紹興文理學(xué)院;2018年

3 馬文心;疏肝益腎方聯(lián)合依西美坦治療ctDNA內(nèi)分泌耐藥基因突變晚期乳腺癌研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 李皓;乳巖寧配合依西美坦對(duì)乳腺癌裸鼠GLUT1和PKM2表達(dá)的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2017年

5 李光;生物轉(zhuǎn)化法制備依西美坦的研究[D];湖南師范大學(xué);2009年

6 楊雅嵐;ESR1基因突變與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的相關(guān)性[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

7 馬丹;疏肝益腎方治療乳腺癌一線AIs失敗后的臨床研究[D];中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院;2015年

8 譚桂蘭;補(bǔ)腎法對(duì)應(yīng)用芳香化酶抑制劑的腎虛型乳腺癌患者的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

9 陳茂偉;生物降解型聚谷氨酸乙酯微球的研究[D];南京工業(yè)大學(xué);2003年

10 恩陽(yáng);系統(tǒng)評(píng)價(jià)芳香酶抑制劑對(duì)一線治療早期乳腺癌的網(wǎng)絡(luò)meta分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2675977