【摘要】：研究背景經(jīng)皮血管腔內(nèi)成形術(shù)(Percutaneous transluminal angioplasty,PTA)是臨床治療心血管疾病最常用的手段之一,在臨床中挽救了很多冠心病、頸動(dòng)脈狹窄、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的患者,但是PTA的主要缺點(diǎn)是術(shù)后易出現(xiàn)血管彈性回縮和內(nèi)膜增生造成血管再狹窄(re-stenosis,RS),嚴(yán)重影響患者的遠(yuǎn)期療效和生存質(zhì)量。刺芒柄花素(Formononetin,FMN)是雞血藤等很多中藥材的主要活性成分之一,且在2010版中國(guó)藥典中被作為雞血藤的定性指標(biāo),其藥理活性包括抗腫瘤,清除氧自由基,減少細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物,降低膽固醇等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,雞血藤的主要成分刺芒柄花素可能具有抗血小板血小板聚集、抑制血栓血栓形成和抑制內(nèi)膜增生的作用。在此研究中,我們旨在研究雞血藤中刺芒柄花素等主要成分的測(cè)定及在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)情況,并研究刺芒柄花素對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中頸動(dòng)脈損傷的作用及對(duì)血小板聚集作用,同時(shí)研究了體內(nèi)外對(duì)頸動(dòng)脈球囊損傷引起的新生血管內(nèi)膜形成及PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和遷移能力的影響,并進(jìn)一步研究了其潛在的作用機(jī)制。試驗(yàn)方法第一部分UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血清中雞血藤提取物中刺芒柄花素等四種黃酮類化合物方法的建立及藥代動(dòng)力學(xué)研究采用臨床常用水煎方法,并脫水濃縮制備凍干雞血藤提取物。雞血藤水煎3小時(shí),濾液脫水后制成凍干CSE;標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制樣本的準(zhǔn)備,混合母液是含有濃縮的原兒茶酸、兒茶酸、沒食子兒茶素0.5mg/ml,刺芒柄花素0.8mg/ml的甲醇溶液,按(1:1:1:1,v/v/v/v)進(jìn)行混合。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(芫花素)母液在甲醇為0.5mg/ml。標(biāo)本準(zhǔn)備,采用乙酸乙酯液液萃取法處理血漿樣品,選擇芫花素作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn),利用超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法建立血漿樣品中原兒茶酸、兒茶酸、沒食子兒茶素、刺芒柄花素的分析方法。驗(yàn)證過程:色譜條件和質(zhì)譜條件優(yōu)化,選擇性和線性范圍,精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn),基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率及穩(wěn)定性試驗(yàn)。選擇SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,灌胃給予雞血藤劑量0.638g/kg(等量于0.64mg/kg原兒茶酸,6.73mg/kg兒茶酸,5.17mg/kg沒食子兒茶素,1.06mg/kg刺芒柄花素)。雞血藤提取物灌胃之前和之后的9個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采取大鼠眶下靜脈收集血液樣品于肝素化試管中,離心后,儲(chǔ)存于-80℃。運(yùn)用DAS 2.1套裝程序,以非室模型分析血藥濃度VS時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算出藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。第二部分刺芒柄花素在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中對(duì)血管內(nèi)膜增生和血小板聚集作用研究構(gòu)建大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型,90只大鼠隨機(jī)分為分為6組,每組15只,分組情況如下:假手術(shù)組,模型組,模型給予低中高三個(gè)劑量刺芒柄花素組(刺芒柄花素低劑量組25 mg/Kg,刺芒柄花素中劑量組50 mg/kg,刺芒柄花素高劑量組100 mg/kg),阿司匹林對(duì)照組(10 mg/kg)。手術(shù)后第二天起開始給藥,持續(xù)給藥2周。Born比濁法測(cè)定血小板聚集率;硝酸還原酶法檢測(cè)血清一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,放射免疫法檢測(cè)血清中內(nèi)皮素-1(endothelin l,ET-1)、血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)水平,ELISA檢測(cè)血清中血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、前列環(huán)素(Epoprostenol,PGI2)水平;HE觀察頸動(dòng)脈病理變化。第三部分刺芒柄花素對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生及血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響和機(jī)制研究建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型用于評(píng)價(jià)刺芒柄花素抑制血管損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生的作用。HE染色進(jìn)行頸動(dòng)脈病理學(xué)觀察。分離培養(yǎng)原代大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞SMCs,CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刺芒柄花素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的SMCs細(xì)胞增殖和遷移的作用。免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)各組動(dòng)脈組織和原代培養(yǎng)的SMCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(Transforming growth factor-a,TGF-a)表達(dá)水平。Smad3/p-Smad3表達(dá)通過western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血清中雞血藤提取物中刺芒柄花素等四種黃酮類化合物方法的建立及藥代動(dòng)力學(xué)研究UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血清中雞血藤四種黃酮類化合物方法的建立及藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。在優(yōu)化色譜分析及質(zhì)譜分析中,對(duì)于陽性和陰性電離模式同時(shí)被優(yōu)化。分析物和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的電離,相對(duì)給予負(fù)離子模式比陽離子模式更多的強(qiáng)烈反應(yīng)。通過優(yōu)化,對(duì)于所有化合物的測(cè)試,0.05%甲酸可以增強(qiáng)離子化的效應(yīng),獲取得更多比純蒸餾水。為了獲取滿意的敏感度和好的峰值形態(tài),我們選取0.05%甲酸和甲醇(35:65,v/v)作為等度洗脫液。原兒茶酸、兒茶酸、沒食子兒茶素、刺芒柄花素和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間分別為:1.1,1.1,1.1,2.2和4min。應(yīng)用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取最終確定下來,簡(jiǎn)單和可重復(fù)提取并有很好的回收率。在0.5-200ng/ml范圍對(duì)于原兒茶酸、兒茶酸、沒食子兒茶素和0.8-320ng/ml范圍刺芒柄花素呈線性。校準(zhǔn)曲線的系數(shù)(r)對(duì)所有的校正曲線0.99。最低量化下限(LLOQ)定義為信噪比10,準(zhǔn)確度和精確度在±20%范圍內(nèi)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示AUC0-t價(jià)值對(duì)于兒茶酸和沒食子兒茶素分別為67.52±9.47和63.64±19.37μg h/l。兒茶酸和沒食子兒茶素(6.73mg/kg兒茶酸和5.17mg/kg沒食子兒茶素)在相同劑量水平時(shí)顯示有相似的口服吸收率,結(jié)果是因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)。同時(shí)也觀察到口服沒食子兒茶素濃度比刺芒柄花素高5倍時(shí)在血清濃度-時(shí)間曲線中AUC0-t價(jià)值是相似的,表明大鼠對(duì)于刺芒柄花素的吸收明顯大于沒食子兒茶素。本研究結(jié)果對(duì)于研究雞血藤提取物的主要成分的作用機(jī)制具有重要意義,同時(shí)對(duì)于中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究也提供了有效的工具。2.刺芒柄花素在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型抑制抗血小板聚集和血管內(nèi)膜增生刺芒柄花素給藥顯著改善大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中頸動(dòng)脈血管組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變,緩解內(nèi)膜增生。與模型組相比,刺芒柄花素顯著抑制了血小板聚集,使其PAGmax、IR顯著降低,且與模型組存在顯著性差異(p0.05)。與模型組相比,刺芒柄花素劑量組NO、PGI2水平顯著升高,且存在顯著性差異(p0.05)。各給藥組血清ET-1、TXA2、PDGF水平顯著降低,且存在顯著性差異(p0.05)。3.刺芒柄花素通過調(diào)節(jié)TGF-al/Smad3信號(hào)通路抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移保護(hù)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生刺芒柄花素顯著改善大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型血管內(nèi)膜增生,新生內(nèi)膜中的平滑肌細(xì)胞較模型組明顯減少,內(nèi)皮較完整光滑,內(nèi)膜增生較輕,抑制新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖,血管結(jié)構(gòu)變化與模型組相比明顯得到改善。刺芒柄花素處理能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的體外SMCs細(xì)胞增殖(p0.05),降低Transwell遷移試驗(yàn)中穿過小室的細(xì)胞數(shù)和劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移率(p0.05)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)刺芒柄花素能夠降低血管平滑肌細(xì)胞TGF-a表達(dá)水平,并且Smad3表達(dá)也能被刺芒柄花素顯著抑制。結(jié)論1.UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠血清中雞血藤四種黃酮類物質(zhì)的含量,刺芒柄花素大鼠體內(nèi)吸收率最高,推測(cè)刺芒柄花素是雞血藤抗血小板聚集、抑制內(nèi)膜增生的主要活性成分。2.刺芒柄花素各劑量組能改善大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型血管內(nèi)膜增生,可顯著抑制ADP,膠原、AA誘血小板聚集現(xiàn)象,顯著提高血清中NO含量、明顯降低ET-1、PDGF水平,糾正TXA2/PGI2失衡,從而達(dá)到抗血小板聚集、抑制內(nèi)膜增生作用。3.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明刺芒柄花素能夠顯著改善大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷,具體作用機(jī)制可能與抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,調(diào)節(jié)TGF-al/Smad3信號(hào)通路有關(guān),從而緩解球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑３．結(jié)果逡逑３．１．大鼠頸總動(dòng)脈病理學(xué)形態(tài)觀察逡逑ＨＥ染色（ｘ４００）邋２邋ｗ頸動(dòng)脈病理切片結(jié)果顯示，假手術(shù)組頸總動(dòng)脈內(nèi)膜逡逑完整，中膜ＶＳＭＣ排列規(guī)則，彈力膜規(guī)則且清晰；模型組動(dòng)物頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增逡逑生最為嚴(yán)重，可見內(nèi)膜修復(fù)不完整，不連續(xù)的內(nèi)彈力板，頸總動(dòng)脈血管腔內(nèi)面逡逑不光滑，，細(xì)胞排列紊亂，大量平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移增生，內(nèi)膜明顯增逡逑厚，有大量基質(zhì)積累，管腔明顯變窄。阿司匹林組血管內(nèi)膜增厚得以改善，內(nèi)逡逑膜仍可見平滑肌細(xì)胞增殖。其余各給藥組新生內(nèi)膜中的平滑肌細(xì)胞較模型組明逡逑顯減少，內(nèi)皮較完整光滑，內(nèi)膜增生較輕。刺芒柄花素三組從低劑量到高劑逡逑量，組織病理學(xué)形態(tài)內(nèi)膜增生抑制程度更加明顯。逡逑

圖２阿司匹林、刺芒柄花素對(duì)三種不同誘導(dǎo)劑ＡＡ、ＡＤＰ、膠原所誘導(dǎo)的血小逡逑板聚集功能的影響逡逑３．３邋血清中邋ＮＯ、ＥＴ－１、ＰＤＧＦ、ＴＸＡ２、ＰＧＩ２邋含量測(cè)定逡逑血清中ＮＯ、ＥＴ－１、ＰＤＧＦ、ＴＸＡ２、ＰＧＩ２含量測(cè)定如下（詳細(xì)數(shù)據(jù)參見附表逡逑２）：逡逑１）血清ＮＯ含量逡逑球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈后，除阿司匹林組與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異逡逑夕卜，其他各組包括模型組及刺芒柄花素各劑量給藥組均較假手術(shù)組降低，且差逡逑異有顯著性（Ｐ＜０．００１）。各給藥組ＮＯ水平較模型組顯著增高，且刺芒柄花素逡逑各劑量組ＮＯ水平從低劑量到高劑量顯著升高，成劑量依賴性。并且發(fā)現(xiàn)，阿逡逑司匹林聯(lián)合刺芒柄花素組ＮＯ水平較阿司匹林組有顯著性差異。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2675926