【摘要】：目的:觀察石蓮花溶液(Graptopetalum solution,GP)對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)介導(dǎo)的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞所構(gòu)建的體外肺纖維化細(xì)胞模型的影響,探討石蓮花溶液是否具有抗肺纖維化的作用。方法:第一部分,采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞構(gòu)建體外肺纖維化模型,通過形態(tài)學(xué)觀察、熒光定量PCR、Western-blot及免疫組化分析A549細(xì)胞中E鈣蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I,Col-I)和纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)mRNA及其蛋白的表達(dá)來鑒定模型。進(jìn)而,分別對纖維化模型A549細(xì)胞給予石蓮花溶液(1250μg/mL)干預(yù)并以地塞米松(Dexamethasone,DXM)(120 μg/mL)作為陽性對照,干預(yù)時(shí)間均為48、72h,MTT法檢測干預(yù)后各組A549細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組A549細(xì)胞的凋亡情況,熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測各組A549細(xì)胞E-Cad、Col-I和FN的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。之后,運(yùn)用熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測石蓮花對TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路相關(guān)蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表達(dá)影響。第二部分,采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞構(gòu)建體外肺纖維化模型,通過熒光定量PCR、Western-blot及免疫組化分析HLF細(xì)胞中αa-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、Col-I和FN mRNA及其蛋白的表達(dá)來鑒定模型。進(jìn)而,分別對纖維化模型HLF細(xì)胞給予石蓮花溶液(650 μg/mL)干預(yù)并以地塞米松(120μg/mL)作為陽性對照,干預(yù)時(shí)間均為48、72h,MTT法檢測干預(yù)后各組HLF細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組HLF細(xì)胞的凋亡情況,熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測各組HLF細(xì)胞α-SMA、Col-I和FN的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。之后,運(yùn)用熒光定量PCR、Western-blot和免疫組化檢測石蓮花對TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號通路相關(guān)蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表達(dá)影響。結(jié)果:A549細(xì)胞經(jīng)5 ng/mL TGF-β1作用7天后細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞形態(tài)呈間質(zhì)細(xì)胞的紡錘體形狀樣改變;與常規(guī)培養(yǎng)的A549細(xì)胞比較,E-CadmRNA及其蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05或P0.01),而Col-I和FNmRNA及其蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)(P0.05或P0.01),具有纖維化細(xì)胞的特征。石蓮花溶液和地塞米松對纖維化模型A549細(xì)胞的增殖均具有抑制作用(IC50=1249.617 μg/mL和 118.713 μg/mL),并促進(jìn)其凋亡(與模型組比較,P0.05或P0.01),還可上調(diào)E-CadmRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.05或P0.01),而下調(diào)Col-I及FNmRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.05或P0.01);比較二者的干預(yù)效果,石蓮花溶液上調(diào)E-Cad表達(dá)水平及下調(diào)Col-I及FN表達(dá)水平的作用不及地塞米松,但干預(yù)72h二者間基因及蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。石蓮花溶液和地塞米松均可下調(diào)Smad2和Smad4 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.01),并上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.01);比較二者的干預(yù)效果,石蓮花溶液下調(diào)Smad2和Smad4表達(dá)水平及上調(diào)Smad7表達(dá)水平的作用不及地塞米松,但干預(yù)72h二者間蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。HLF細(xì)胞經(jīng)5ng/mLTGF-β1作用7天后,與常規(guī)培養(yǎng)的HLF細(xì)胞比較,α-SMA、Col-I和FN mRNA及其蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)(P0.05或P0.01)。石蓮花溶液和地塞米松對纖維化模型HLF細(xì)胞的增殖均具有抑制作用(IC50=647.620μg/mL和117.939μg/mL),并促進(jìn)其凋亡(與模型組比較,p0.01),還可下調(diào)α-SMA、Col-I及FN mRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.05或P0.01);比較二者的干預(yù)效果,石蓮花溶液下調(diào)α-SMA、Col-I及FN表達(dá)水平的作用不及地塞米松,但干預(yù)72h除石蓮花溶液對FN蛋白的調(diào)節(jié),二者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。石蓮花溶液和地塞米松均可下調(diào)Smad2和Smad4mRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.05或P0.01),并上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平(與未干預(yù)組比較均為P0.05或P0.01);比較二者的干預(yù)效果,石蓮花溶液下調(diào)Smad2和Smad4表達(dá)水平及上調(diào)Smad7表達(dá)水平的作用不及地塞米松,但干預(yù)72h二者間蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)TGF-β1可介導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖,也可介導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的活化和增殖,表明,兩種類型細(xì)胞的體外肺纖維化模型構(gòu)建成功。(2)石蓮花溶液可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)該細(xì)胞凋亡,并可抑制該細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。(3)石蓮花溶液能夠抑制由TGF-β1介導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞系HLF細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的活化增殖,并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。(4)石蓮花溶液能夠降低Smad2和Smad4 mRNA和蛋白的表達(dá)量,并升高Smad7 mRNA和蛋白的表達(dá)量,提示石蓮花溶液干預(yù)肺纖維化過程可能是通過對TGF-β1/Smad通路的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

時(shí)問（ｆｃ，逡逑注：與其他各濃度組比乾叩＜０．０５逡逑圖１－１邋Ａ５４９細(xì)胞在不同濃度ＴＧＦ－ｐｉ刺激下生長曲線逡逑１．２確定建模所需時(shí)間逡逑Ａ５４９細(xì)胞經(jīng)５ｎｇ／ｍＬ邋ＴＧＦ－ｐｉ體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察可見模型組細(xì)胞隨逡逑著時(shí)間的延長，，間隙增寬，由原有的鶴卵石形狀逐漸變成紡錐體形狀，且部分細(xì)胞邊緣可逡逑見毛刺樣改變，在第７天，Ａ５４９細(xì)胞完全由上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，而對照逡逑組并無明顯的改變（圖１－２）。因此，確定７天為Ａ５４９細(xì)胞體外構(gòu)建肺纖維化細(xì)胞模型的所逡逑需時(shí)間。逡逑WW逡逑對照組１天邐對暖組３天邐對膀}D７天邐逡逑曲曲逡逑ＴＧＦ－ｐｌ巧導(dǎo)４天邐ＴＧＦ韋１誘將５天邐ＴＧＦ－ｊＳｌ巧導(dǎo)６天逡逑ＴＧＦ書１巧導(dǎo)７天逡逑圖１－２模型組Ａ５４９細(xì)胞形態(tài)學(xué)演變過程（ｘｌＯＯ）逡逑１７逡逑

著時(shí)間的延長，間隙增寬，由原有的鶴卵石形狀逐漸變成紡錐體形狀，且部分細(xì)胞邊緣可逡逑見毛刺樣改變，在第７天，Ａ５４９細(xì)胞完全由上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，而對照逡逑組并無明顯的改變（圖１－２）。因此，確定７天為Ａ５４９細(xì)胞體外構(gòu)建肺纖維化細(xì)胞模型的所逡逑需時(shí)間。逡逑WW逡逑對照組１天邐對暖組３天邐對膀}D７天邐逡逑曲曲逡逑ＴＧＦ－ｐｌ巧導(dǎo)４天邐ＴＧＦ韋１誘將５天邐ＴＧＦ－ｊＳｌ巧導(dǎo)６天逡逑ＴＧＦ書１巧導(dǎo)７天逡逑圖１－２模型組Ａ５４９細(xì)胞形態(tài)學(xué)演變過程（ｘｌＯＯ）逡逑１７逡逑
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2672637