【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已確定古方天灸藥物白芥子散穴位貼敷治療哮喘最佳配比的基礎(chǔ)上,確定應(yīng)用古方天灸藥物白芥子散進(jìn)行穴位貼敷治療對(duì)哮喘大鼠的氣道炎癥有顯著地抑制作用和免疫調(diào)節(jié)作用,促使免疫功能恢復(fù)正常,即古方天灸藥物白芥子散在免疫穩(wěn)態(tài)重建中有重要作用。擬從基因角度對(duì)白芥子散在小兒哮喘的發(fā)病機(jī)制、免疫穩(wěn)態(tài)重建機(jī)制、治療機(jī)制等方面進(jìn)行研究,提高哮喘的診斷準(zhǔn)確性和治療靶向性,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論支撐。方法將雄性清潔SD大鼠90只,4~6周齡,體重(150±20)g,按均衡隨機(jī)法(按體重分層)分為3組,分別為給藥組、模型組A組和B組(各15只)、正常組,每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只。第1天,給藥組、模型組分別于用新鮮配制的OVA,100mg輔以氫氧化鋁凝膠200mg及生理鹽水1ml的混懸液在大鼠兩腹股溝、后足跖,共4點(diǎn)做皮下注射,每點(diǎn)0.2ml,同時(shí)腹腔注射0.2ml,正常組不做任何處理。第15天中處死模型組A組,正常組5只大鼠,收集并保存需檢測(cè)部位的標(biāo)本,以便于確認(rèn)造模成功后動(dòng)物的體內(nèi)基因表達(dá)狀態(tài),模型組B組留用作為治療對(duì)照。第15~24天給藥組開(kāi)始進(jìn)行天灸貼敷治療,穴位貼敷前用8%硫化鈉在穴位處脫毛,將藥丸放在醫(yī)用脫敏膠貼上,分別貼于大鼠肺俞(雙)、定喘、膻中、膏肓(雙)處,每天1次,每次貼敷2~4h,貼敷治療后,將實(shí)驗(yàn)組致敏的大鼠置于密閉容器內(nèi)用超聲霧化器霧化吸入2%OVA生理鹽水懸液,每天30min,進(jìn)行激發(fā)誘喘1次,連續(xù)10天。模型組B組予空白貼敷,處理方法同給藥組。正常組自由進(jìn)食常規(guī)飼料和水。第25天處死大鼠,采集肺組織標(biāo)本。進(jìn)行RNA的提取及鑒定、基因芯片的檢測(cè)、生物信息學(xué)分析、采用Western blot、Northern bLot、熒光定量RT-PCR檢測(cè)和基因敲除技術(shù)對(duì)基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果(1)造模成功判定:與正常組對(duì)比,模型組大鼠在行為學(xué)、病理學(xué)及基因?qū)W上有顯著變化,造模成功。(2)送檢9只大鼠的肺組織中提取的基因,將所得基因結(jié)果根據(jù)基因庫(kù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除,按照p0.05,以基因表達(dá)倍數(shù)值的絕對(duì)值≥2.0為閾值來(lái)確定差異表達(dá)基因。結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這些基因與哮喘的發(fā)生發(fā)展均有直接或者間接的關(guān)系。正常組與模型組A組比較,正常組中下調(diào)的17個(gè)基因,上調(diào)的6個(gè)基因,模型組A組呈現(xiàn)相反的變化,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,哮喘模型建立成功。正常組和模型組B組、給藥組比較,差異表達(dá)基因相同,上調(diào)基因有4個(gè),下調(diào)基因有2個(gè),給藥組基因上下調(diào)倍數(shù)明顯高于模型組B組,上調(diào)基因和下調(diào)基因減少。模型組A組和模型組B組、給藥組比較,上調(diào)基因有兩個(gè),下調(diào)基因有6個(gè),給藥組基因上下調(diào)倍數(shù)明顯高于模型組B組,模型組A組中上調(diào)的基因在模型組B組、給藥組中下調(diào),下調(diào)的基因不表達(dá)或者低表達(dá),模型組B組、給藥組出現(xiàn)了兩個(gè)上調(diào)基因,其均有抗炎作用。模型組B組和給藥組比較中,無(wú)表達(dá)下調(diào)基因,表達(dá)上調(diào)基因有8個(gè)。結(jié)果提示模型組B組自身免疫恢復(fù),給藥組用藥后免疫恢復(fù),且治療效果優(yōu)于模型組B組,尚未恢復(fù)到正常狀態(tài)。(3)將正常組、模型組和給藥組的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較,通過(guò)熱圖可以發(fā)現(xiàn),正常大鼠的基因表達(dá)中通過(guò)不同基因的上調(diào)和下調(diào)或者不表達(dá)來(lái)維持免疫穩(wěn)態(tài),模型組和給藥組的基因也出現(xiàn)了上調(diào)與下調(diào)來(lái)應(yīng)對(duì)哮喘的發(fā)生,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,發(fā)現(xiàn)與哮喘有關(guān)的上調(diào)基因有18個(gè),下調(diào)基因有7個(gè)。通過(guò)各個(gè)基因作用對(duì)比分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已經(jīng)發(fā)表的一些相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致,也與基因的功能相一致。結(jié)論1.差異表達(dá)基因與哮喘發(fā)生機(jī)制的關(guān)系:與EOS有關(guān),參與氣道炎癥形成、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑過(guò)程的基因有:EOS趨化性細(xì)胞因子CCR3、Ccl11、Ccl2、Ccl22;有抗炎作用的基因:ADM、Pla2g4c、Fcgr3a、Nr1d1、Acox1;參與氣道炎癥的基因有:C3、SelP、Sele、Serpina3n、CX3CR1;參與氣道炎癥和氣道重塑的基因有:MMP-9、TLR1;抗氣道炎癥和氣道重塑的基因有:Timp1;與哮喘密切相關(guān),但是尚不清楚發(fā)生機(jī)制的基因有:prim1、Serpinb10、FMO3、Scd1、per3、DBP、ANKRD1、CD177、DES。2.正常組和模型組A組比較,基因上下調(diào)明顯,基因與哮喘形成的三種機(jī)制均有關(guān)系,哮喘模型建立成功,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組、模型組A組分別和模型組B組、給藥組相比,差異表達(dá)基因相同,給藥組基因上下調(diào)倍數(shù)高于模型組B組,兩組組間比較,差異表達(dá)基因全部是上調(diào),無(wú)下調(diào)基因,說(shuō)明天灸藥物白芥子散治療哮喘大鼠后,較之模型組A組、B組哮喘情況有所好轉(zhuǎn),較之正常組仍有哮喘炎癥的存在,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.正常情況下,免疫穩(wěn)態(tài)維持大鼠生命的基本狀態(tài),哮喘大鼠伴隨著免疫穩(wěn)態(tài)的打破,與哮喘相關(guān)的基因也發(fā)生變化,在熱圖中可以明顯看出基因上下調(diào)變化,原本應(yīng)該上調(diào)的基因,轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào),原本下調(diào)的基因轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào),原本不表達(dá)或者低表達(dá)的基因開(kāi)始表達(dá),將正常組、模型組和給藥組的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)與哮喘有關(guān)的上調(diào)基因有18個(gè),下調(diào)基因有7個(gè),通過(guò)各個(gè)基因作用對(duì)比分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已經(jīng)發(fā)表的一些相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致,也與基因的功能相一致,在基因上,哮喘大鼠的基因發(fā)生了改變,其中部分基因或者基因多態(tài)性在在哮喘中明確發(fā)揮著重要的作用,能夠?yàn)橹委熛拿庖叻�(wěn)態(tài)的重建過(guò)程提供一個(gè)方向。
【圖文】：

正常組 模型組 A 組.3 大鼠差異表達(dá)基因熱圖改變附圖于資金有限，未能將提取的全部大鼠基因送檢，正常組隨機(jī)抽取 3 只送檢 A 組隨機(jī)抽取 2 只送檢，，B 組提取一只送檢，給藥組隨機(jī)抽取 3 只送檢小批量篩選，得到結(jié)果后以便后期進(jìn)行大批量驗(yàn)證。結(jié)果中按照編號(hào)， 3 號(hào)，8 號(hào)，21 號(hào)，模型組 A 組為 5 號(hào)，9 號(hào)，B 組為 18 號(hào)，給藥組15 號(hào)，26 號(hào)。將 3 組所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，得到以下熱圖：

圖 2 給藥組與正常組差異表達(dá)基因熱圖結(jié)果比較圖 3 給藥組和模型組差異表達(dá)基因熱圖結(jié)果比較從以上熱圖可以看出，在正常組中，部分基因呈現(xiàn)上調(diào)，部分基因呈現(xiàn)下調(diào)基因不表達(dá)或者低表達(dá)，從而維持健康狀況下的免疫穩(wěn)態(tài)，在模型組和給原本應(yīng)該上調(diào)的基因發(fā)生下調(diào)，原本應(yīng)該下調(diào)的基因發(fā)生上調(diào)，部分基因
【學(xué)位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2669934