【摘要】：第一部分黃芩素的體外代謝研究目的:研究黃芩中的主要活性成分黃芩素在人體中的主要代謝途徑,明確其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型,闡明參與其代謝的主要代謝酶及相關(guān)的主要單酶亞型,代謝動力學特征;黃芩素代謝的種屬間差異;評價黃芩素和代謝產(chǎn)物的藥理活性,為黃芩素的臨床合理應(yīng)用提供一定的參考。方法:(1)體外代謝實驗:利用體外人的肝S9,HLC,HLM,混合腸微粒體,腸S9,14種UGT重組單酶亞型及常用的實驗動物S9(食蟹猴Cy LS9,大鼠Rt LS9,小鼠Ms LS9,豚鼠GLS9,比格犬DLS9,兔Ra LS9,豬PLS9)對黃芩素的代謝途徑,代謝酶歸屬,動力學模型,表觀動力學參數(shù)以及代謝的種屬間差異進行詳細研究;(2)利用生物合成方法制備相關(guān)代謝產(chǎn)物,并利用植物化學和相關(guān)波譜學方法對其代謝產(chǎn)物進行分離純化并鑒定其結(jié)構(gòu),明確其代謝位點;(3)利用LPS刺激RAW264.7細胞釋放NO構(gòu)建炎癥模型,評價原形藥物和其代謝產(chǎn)物的抗炎活性。結(jié)果:黃芩素在人肝S9中經(jīng)COMT催化生成6-O-甲基黃芩素(M-1:木蝴蝶素A),S-COMT主要介導了黃芩素的甲基化代謝,相比野生型S-COMT其108m位點突變株S-COMT(108m)表現(xiàn)出較低的催化活力;黃芩素的甲基化代謝在HLS9,HLC,HLM,HIS9及S-COMT中的代謝特征均遵循經(jīng)典米氏動力學;并求得相應(yīng)的表觀動力學參數(shù)(Vmax,Km,Ki和CLint);黃芩素的甲基化產(chǎn)物(木蝴蝶素A)作為中間代謝產(chǎn)物可以快速的被UGTs進一步代謝生成黃芩素-6-O-甲基-7-O-葡萄糖醛酸苷結(jié)合物隨尿液排出體外(M-2:千層紙素A-β-D-葡萄糖醛酸苷)。由單酶歸屬,化學抑制實驗結(jié)果可知,此葡萄糖醛酸化代謝過程主要是UGT1As家族參與;動力學分析結(jié)果顯示產(chǎn)物木蝴蝶素A的UGT代謝在人肝微粒體HLM,UGT1A10,1A9中遵循經(jīng)典米氏動力學,而在人腸微粒體HIM,UGT1A1,1A3,1A7,1A8中表現(xiàn)為底物抑制動力學,并得到動力學參數(shù)(Vmax,Km,Ki和CLint);黃芩素的代謝過程的種屬間差異研究表明:第二步葡萄糖醛酸化代謝過程在所有種屬中均表現(xiàn)出很好的代謝速率,而其甲基化過程在代謝速率,親和力上表現(xiàn)出明顯的種屬間差異,動力學研究顯示猴中甲基化代謝清除過程與人最為接近;體外抗炎活性研究表明黃芩素中間代謝產(chǎn)物M-1(木蝴蝶素A)仍表現(xiàn)較好的抗炎活性,IC50為28μΜ,而終代謝產(chǎn)物千層紙素A-β-D-葡萄糖醛酸苷沒有抗炎活性。結(jié)論:本文首次探究了黃芩素在人體中主要代謝產(chǎn)物千層紙素A-β-D-葡萄糖醛酸苷的代謝形成過程:即先甲基化代謝隨后葡萄糖醛酸化的兩步代謝;S-COMT和UGT1As主導了這兩步代謝過程。研究發(fā)現(xiàn)甲基化代謝過程緩慢,是整個反應(yīng)過程的限速步驟,同時黃芩素的甲基化過程表現(xiàn)出明顯的種屬間差異,其中食蟹猴的代謝動力學和代謝清除率與人的較為接近。因此,基于代謝角度食蟹猴可能更適合作為黃芩素相關(guān)藥理和毒理學研究的模式動物;這些發(fā)現(xiàn)都為黃芩素研究中模式動物的選擇提供一定的參考,同時,也為其臨床合理應(yīng)用和相關(guān)結(jié)構(gòu)的新藥開發(fā)提供寶貴的建議。第二部分迷迭香酸的體外代謝及代謝的種屬差異研究目的:探究迷迭香酸的體外代謝穩(wěn)定性,明確其主要的代謝通路,代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型,參與代謝的主要單酶亞型,代謝動力學特征,以及迷迭香酸代謝的種屬間差異;研究迷迭香酸與多巴胺之間可能存在的藥物-藥物相互作用(DDI),為迷迭香酸的藥物開發(fā)和臨床合理應(yīng)用提供一定的參考。方法:(1)體外實驗:利用體外人肝S9,HLC及常用的實驗動物肝S9(食蟹猴Cy LS9,大鼠Rt LS9,小鼠Ms LS9,豚鼠GLS9,比格犬DLS9,兔Ra LS9,豬PLS9)對迷迭香酸的代謝途徑,動力學模型,表觀動力學參數(shù)和代謝的種屬間差異進行詳細研究;(2)利用生物合成方法制備相關(guān)代謝產(chǎn)物,并利用植物化學和波譜學方法進行分離純化并鑒定結(jié)構(gòu)明確其代謝位點;(3)利用體外孵育體系,評價迷迭香酸對多巴胺的甲基化代謝的抑制活性;進行抑制動力學分析,確定相關(guān)抑制動力學參數(shù)。結(jié)果:通過體外篩選,迷迭香酸在人體內(nèi)主要進行甲基化代謝,其體外甲基化代謝的主要代謝產(chǎn)物為3′(M-1)和4′(M-2)位甲基化產(chǎn)物;迷迭香酸在人肝S9,HLC中的動力學模型均為底物抑制動力學,種屬:M-1在小鼠,豚鼠,豬,兔里的動力學遵循經(jīng)典米氏動力學,在食蟹猴,狗,大鼠里的動力學遵循底物抑制動力學;M-2在小鼠,豚鼠,兔里遵循經(jīng)典米氏動力學,在豬,食蟹猴,狗,大鼠里遵循底物抑制動力學,并得到其相應(yīng)的動力學參數(shù)(Vmax,Km,Ki和CLint);迷迭香酸對多巴胺的甲基化代謝表現(xiàn)出較強的抑制作用,其抑制形式為競爭性抑制,Ki為0.35μM。結(jié)論:本實驗首次對迷迭香酸的代謝穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)篩選,確定了甲基化為其主要的代謝清除路徑,鑒定了甲基化代謝的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和參與的相關(guān)單酶亞型,并詳細描繪了其代謝動力學模型;迷迭香酸的甲基化代謝存在較大的種屬差異�；诖x的角度大鼠可能更適用于作為迷迭香酸相關(guān)藥理學,毒理學研究的模式動物;迷迭香酸對多巴胺的甲基化代謝存在較強的抑制,這為以后迷迭香酸的相關(guān)藥物的開發(fā)和臨床合理使用提供一定的參考。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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