【摘要】：目的:加味當(dāng)歸補(bǔ)血片是依據(jù)“精源于脾,血生于氣,陰陽互根”的中醫(yī)理論,由黃芪、當(dāng)歸以及淫羊藿三味中藥按5:1:5的質(zhì)量比例制成,具有補(bǔ)腎助陽,益氣生血的功效,可用于婦女絕經(jīng)后腎陽虛證所引起的骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)。骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女常見的癥狀,是一種易誘發(fā)骨折風(fēng)險的全身性疾病�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生是由于體內(nèi)雌激素分泌水平下降,骨生成與骨吸收平衡受到破快,骨密度降低而產(chǎn)生的。為預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松引起的骨折的發(fā)生,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常使用激素替代療法,即在婦女圍絕經(jīng)期時開始補(bǔ)充雌激素,以預(yù)防骨質(zhì)疏松。在發(fā)生骨質(zhì)疏松后,患者需長期服用調(diào)節(jié)骨代謝與形成的藥物,雖具有一定的療效,但效果并不滿意。中醫(yī)認(rèn)為,骨質(zhì)疏松可屬于“骨痿”的范疇,與腎密切相關(guān)�！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗分刑岬侥I為先天之本,女性進(jìn)入“七七之年”后,腎氣漸衰,天癸耗竭,陰陽失衡,從而累及各臟腑,產(chǎn)生不同的癥狀,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是其中的表現(xiàn)之一。中醫(yī)治療疾病的特點是整體論治,對絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥而言,常以補(bǔ)先天之腎入手,兼調(diào)后天脾胃氣血,使陰陽平衡、臟腑協(xié)調(diào)。前期通過體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸補(bǔ)血方可以促進(jìn)MG-63骨細(xì)胞的增殖、分化,另一方面可增加受雌激素影響的基因在MCF-7細(xì)胞的表達(dá)水平,說明加味當(dāng)歸補(bǔ)血片可以直接影響成骨過程,也可以起到雌激素樣作用間接促進(jìn)骨生成,從而對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有潛在的預(yù)防和治療作用,但具體的作用機(jī)理及實際效果有待進(jìn)一步明確。另一方面,近年來關(guān)于含淫羊藿制劑造成肝損傷的不良反應(yīng)偶有報道,作為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的用藥,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的用藥周期漫長,而淫羊藿又是加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的重要組成部分,因此其長期安全性需接受更多的考察。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動物實驗的方法,先預(yù)測加味當(dāng)歸補(bǔ)血片抗骨質(zhì)疏松的相關(guān)作用機(jī)制及可能潛在的毒性作用,然后通過動物實驗的方法,對其抗骨質(zhì)疏松的作用及長期安全性進(jìn)行評價,為加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的新藥開發(fā)、臨床應(yīng)用以及深入研究提供基礎(chǔ)。方法:1 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn),篩選出黃芪、當(dāng)歸、淫羊藿三味中藥的化學(xué)成分。設(shè)定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18以及人體腸道細(xì)胞通透性≥-0.4作為藥代動力學(xué)篩選指標(biāo),篩選出加味當(dāng)歸補(bǔ)血片中的入血成分作為活性成分,并從TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找活性成分的預(yù)測作用靶點(Putative target,PT)。通過OMIM、PharmGKB、DurgBank、TTD、CTD數(shù)據(jù)庫查找與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的靶點(Anti-osteoporosis target,AT),將加味 當(dāng)歸補(bǔ)血片活性成分靶點與骨質(zhì)疏松癥靶點進(jìn)行交集,得到加味當(dāng)歸血片直接作用于骨質(zhì)疏松癥的靶點(Putative anti-osteoporosis target,PAT)。另將所有活性成分的作用靶點與骨質(zhì)疏松靶點進(jìn)行并集,利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用關(guān)系(Protein-protein interaction,PPI)分析,構(gòu)建靶點蛋白間的相互關(guān)系,篩選關(guān)聯(lián)度大于2倍平均關(guān)聯(lián)度的關(guān)鍵靶點(Keytarget,KT)作為間接作用于骨質(zhì)疏松癥的靶點。將PAT和KT進(jìn)行并集,得到加味當(dāng)歸血片防治骨質(zhì)疏松癥的核心靶點(Core target,CT)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對CT進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析及通路(Pathway)富集分析,綜合解讀加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的分子作用機(jī)制、生物通路以及潛在藥理活性。2 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的計算毒理學(xué)研究通過計算機(jī)毒理學(xué)預(yù)測軟件eMolTox對加味當(dāng)歸補(bǔ)血片活性成分的潛在毒性進(jìn)行預(yù)測分析,找出加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的潛在毒性富集器官及系統(tǒng)。通過計算機(jī)藥物代謝動力學(xué)軟件admetSAR分析加味當(dāng)歸補(bǔ)血片活性成分與細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)、P糖蛋白(P-glycolprotein,P-gp)以及腎有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Renal organic cation transporter,ROCT)的相互作用,結(jié)合eMolTox預(yù)測分析加味當(dāng)歸血片中可能具有肝毒性及腎毒性的成分。3 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對自然衰老雌鼠骨骼的影響研究以11月齡自然衰老雌鼠作為實驗對象,設(shè)定衰老模型組(蒸餾水);加味當(dāng)歸補(bǔ)血片受試藥組(高劑量0.22g生藥/mL、中劑量O.11g生藥/mL、低劑量0.055g生藥/mL);西藥陽性藥組(結(jié)合雌激素片10.42μg/mL)以及中藥陽性藥組(右歸丸0.45g/mL)。每組8只,按照1mL/100g體重灌胃給藥,每天1次,連續(xù)給藥4個月,末次給藥后動物禁食12h。測定大鼠全身、腰椎、雙側(cè)股骨頸以及雙側(cè)股骨的骨密度(Bonemineral density,BMD);骨小梁面積、骨小梁面積率以及骨小梁數(shù)。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理后比較各組間差異。4 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對自然衰老雌鼠的長期安全性評價研究以11月齡自然衰老雌鼠作為實驗對象,設(shè)定衰老模型組(蒸餾水);加味當(dāng)歸補(bǔ)血片受試藥組(高劑量0.88g生藥/mL、中劑量0.44g生藥/mL、低劑量0.11g生藥/mL,分別為臨床劑量的80、40、10倍)。每組30只,按照1mL/100g體重灌胃給藥,每天1次,連續(xù)給藥6個月,6個月后停藥,停藥后給予等量蒸餾水繼續(xù)觀察1個月。每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動、每日攝食量、飲水和二便情況,每周測攝食量,飲水量1次;給藥前和給藥后每周測體重1次;分別于給藥3個月,6個月及停藥1個月后,禁食14小時,腹主動脈取血,測定血液學(xué)、血液生化指標(biāo)及性激素六項水平;給藥期間及結(jié)束時各組取10只大鼠放血處死,對其進(jìn)行剖檢,肉眼觀察各主要臟器大小、顏色、硬度、表面光滑情況及胸、腹腔有無積液。測心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、子宮、卵巢濕重,求出臟器系數(shù)。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理后比較各組間差異。結(jié)果:1 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果結(jié)果顯示,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片中含有33個入血活性成分,共關(guān)聯(lián)235個PT。通過OMIM、PharmGKB、DurgBank、TTD、CTD 數(shù)據(jù)庫查找與得到 AT 共 132 個,與 PT交集后得到12個PAT。通過PPI分析,得到48個KT。將KT與PAT并集得到53個CT,當(dāng)中包括雌激素受體、雄激素受體、前列腺素G/H合成酶2、血管內(nèi)皮生長因子A等。對53個CT進(jìn)行GO及Pathway富集分析,發(fā)現(xiàn)加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的基因生物過程主要集中在刺激RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、DNA轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控等。通過Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸補(bǔ)血片可通過直接及間接通路影響骨代謝,從而起到防治絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松的作用。另外富集程度較高的還有TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、甲狀腺信號通路等,這些通路與體內(nèi)激素水平變化、心腦血管疾病、絕經(jīng)后多發(fā)腫瘤疾病都有密切的聯(lián)系,為加味當(dāng)歸補(bǔ)血片在絕經(jīng)后各種疾病中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)及研究方向。2 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的計算毒理學(xué)研究結(jié)果結(jié)果顯示,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片預(yù)測得到的主要毒性器官/系統(tǒng)為肝臟及內(nèi)分泌系統(tǒng),提示其肝毒性風(fēng)險及對內(nèi)分泌的影響較大。加味當(dāng)歸補(bǔ)血片活性成分對CYP450的抑制泛雜性以及對P-gp抑制的計算機(jī)預(yù)測結(jié)果提示,淫羊藿中的淫羊藿苷元(lcarintin)以及8-異戊二烯-黃酮(8-prenyl-flavone)是具有高風(fēng)險肝毒性的成分。對活性成分的ROCT抑制預(yù)測分析結(jié)果表明,加味當(dāng)歸血片中活性成分對ROCT無抑制作用,提示其腎毒性風(fēng)險較低。3 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對自然衰老雌鼠骨骼的作用影響結(jié)果結(jié)果顯示,西藥陽性組、中藥陽性組全身、腰椎、雙側(cè)股骨頸及雙側(cè)股骨BMD均高于衰老模型組,其中西藥陽性組、中藥陽性組全身骨密度與模型組比較,有顯著性差異(P0.05),說明雌性自然衰老大鼠骨質(zhì)疏松模型造模成功。加味當(dāng)歸補(bǔ)血片高、中、低劑量組全身、腰椎、左側(cè)股骨頸及雙側(cè)股骨BMD均高于衰老模型組,其中的中、低劑量組全身BMD,低劑量組腰椎BMD,高劑量組右股骨BMD與模型組比較,有顯著差異(P0.05)。另一方面,西藥陽性組、中藥陽性組及各給藥組的骨小梁面積、骨小梁面積率及骨小梁數(shù)均高于衰老模型組,部分組別與空白組比較有極顯著差異(P0.01)或顯著差異(P0.05)。以上結(jié)果表明,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片可提高自然衰老雌鼠的BMD,緩解自然衰老雌鼠骨小梁的結(jié)構(gòu)退化,提示加味當(dāng)歸補(bǔ)血片有一定的抗骨質(zhì)疏松作用。4 加味當(dāng)歸補(bǔ)血片對自然衰老雌鼠的長期安全性評價結(jié)果結(jié)果顯示,包括空白組在內(nèi)各組動物一般狀態(tài)良好,外觀體征、行為活動、進(jìn)食量、飲水、體重增長等均無異常變化;加味當(dāng)歸補(bǔ)血片三個劑量組及對照組血液學(xué)檢查、血液生化學(xué)檢查均在正常范圍,部分指標(biāo)如尿酸、血糖、甘油三酯給藥組與空白組比較有下降趨勢;各組主要臟器組織病理學(xué)檢查未見明顯異常。上述指標(biāo)停藥1月后也未見改變。對激素六項水平的檢查發(fā)現(xiàn),與空白組相比,各給藥組在給藥3個月、6個月及停藥1個月后的雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)、睪酮(Testosterone,T)水平升高,卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizinghormone,LH)和泌乳素(Prolactin,PRL)水平降低。結(jié)果表示,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片低、中、高三個劑量給藥6個月后對自然衰老雌鼠的基本狀態(tài)無明顯影響,恢復(fù)期觀察1月后也未見延遲性毒性反應(yīng)。對激素水平影響的結(jié)果提示,加味當(dāng)歸補(bǔ)血片具有一定的雌激素樣作用,提示加味當(dāng)歸補(bǔ)血片臨床應(yīng)用劑量的安全性較高,對調(diào)節(jié)自然絕經(jīng)后內(nèi)分泌水平紊亂具有一定的作用,在治療絕經(jīng)前后諸證具有一定的臨床應(yīng)用價值。結(jié)論:對加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸補(bǔ)血片能通過多個作用靶點,多種生物通路影響骨生成,為加味當(dāng)歸補(bǔ)血片應(yīng)用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供了解釋。研究同時也發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸補(bǔ)血片在提高免疫力,腫瘤疾病,心腦血管疾病等方面有潛在的應(yīng)用前景。通過計算機(jī)毒理研究發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸血片對肝臟及內(nèi)分泌系統(tǒng)具有潛在毒性或重要影響,其中預(yù)測肝毒性高風(fēng)險成分來源于淫羊藿,與文獻(xiàn)報道相符。通過長期安全性評價研究發(fā)現(xiàn),加味當(dāng)歸補(bǔ)血片的臨床應(yīng)用劑量對肝功能、腎功能沒有影響,提示其臨床應(yīng)用劑量安全性較高。此外觀察也發(fā)現(xiàn)加味當(dāng)歸補(bǔ)血片能調(diào)節(jié)體內(nèi)E2、P、T、LH、FSH以及PRL的水平,提示加味當(dāng)歸補(bǔ)血片是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平、促進(jìn)骨生成而起到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用,可作為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物進(jìn)行開發(fā)。
【圖文】：

核心作用靶點。將核心靶點進(jìn)行基因本體及生物通路富集分析，預(yù)測并解釋加味當(dāng)歸逡逑補(bǔ)片防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。逡逑技術(shù)流程見圖１。逡逑＾邐，邋，邐＾逡逑ｆ邐、廣邋ＯＭＩＭ‘〕逡逑＾邋．[齙備懼危希遙眨牽攏粒危隋義希椋ゅ澹掊澹掊危�，逦．逦－邋＼逦名－辶x弦誨宥梗″緯б灰誨危叮義希危�，ｓ＾Ｚｉ＾＾逦＃�＃悖簦洌]3?於ａ．分血片邐Ｉ活性成分祀點邐＾？逸ｉ松}\0點；逡逑Ｖ邐邐邋ＡＴ邐Ｊ逡逑ｌ｜邋１１１逡逑，，邐．ｒＶｗｒＴＴＢ、邐Ｉ邐晷逡逑■灥＿邐ＣＺＯ）邐Ｉ邐%煎義�？＿■埼Ｗ＇褦n灣蝵|：媂邐kw邐．二．逡逑ｉ—邋：邐

本文編號：2669375