【摘要】：藥物納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液(Nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions,NSSPE)是一種新型乳液,此劑型可提高難溶性成分的口服生物利用度。課題組前期以葛根素(Puerarin,Pu)為模型藥,以川芎油:油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944 CS)=9:1(v/v)為油相,成功構(gòu)建了葛根素NSSPE(Puerarin nanocrystals self-stabilized Pickering emulsion,Pu-NSSPE)。大鼠灌胃給藥的藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)證實(shí),Pu-NSSPE相對(duì)于Pu原料藥混懸液、納米晶混懸液(NCS)、含吐溫80的普通乳的生物利用度分別為262.43%、155.92%和223.65%。然而,課題組并未對(duì)NSSPE的口服吸收機(jī)制進(jìn)行研究。NSSPE作為一種全新的藥物載體,為何可以顯著提高難溶性藥物的口服生物利用度待進(jìn)一步探討。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,從模擬胃腸液中狀態(tài)變化和藥物釋放,腸吸收動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞吸收與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)3個(gè)方面對(duì)Pu-NSSPE口服后的體內(nèi)變化和吸收機(jī)制進(jìn)行研究,通過與Pu原料藥混懸液、納米晶混懸液和含吐溫80的普通乳比較,揭示NSSPE促進(jìn)難溶性藥物Pu口服吸收的機(jī)制。具體研究方法和結(jié)果如下:(1)Pu原料藥混懸液、納米晶混懸液、含吐溫80的普通乳和NSSPE 4種供試制劑的制備與性質(zhì)考察制備4種供試制劑:(1)原料藥混懸液:Pu加入到含0.3%CMC-Na的pH為11.5的純水中,水浴超聲分散;(2)NCS:Pu加入到pH為11.5的純水中,高剪切后高壓均質(zhì);(3)含吐溫80的普通乳:Pu與川芎油,Labrafil M 1944 CS和吐溫80,攪拌溶解后加入pH為11.5的純化水,高剪切后高壓均質(zhì);(4)NSSPE:Pu加入到pH為11.5的純水中,高壓均質(zhì)先制得Pu納米晶混懸液,再加入川芎油與Labrafil M 1944 CS的混合油相,繼續(xù)高壓均質(zhì)。從粒徑、電位、藥物含量、pH、乳滴形態(tài)和穩(wěn)定性等方面對(duì)供試制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,原料藥混懸液中葛根素微粒的粒徑為91.32?1.73?m,5 min即發(fā)生明顯的沉降;NCS中葛根素納米晶的粒徑為250.03±15.65 nm,zeta電位為-29.10?4.12 mV,1 d內(nèi)穩(wěn)定;含吐溫80的普通乳與NSSPE的乳滴粒徑分別為5.59?0.26?m和13.92?0.94?m,zeta電位分別為-39.9±0.5 mV和-46.0±2.36 mV,室溫放置14 d后仍保持穩(wěn)定。各制劑的最終pH均在6-7的范圍內(nèi)。(2)Pu原料藥混懸液、納米晶混懸液、含吐溫80的普通乳和NSSPE在模擬胃腸液中的狀態(tài)變化和藥物釋放體外模擬胃腸液環(huán)境,以含吐溫80的普通乳為對(duì)照,研究了NSSPE在模擬胃腸液中的狀態(tài)變化。以原料藥混懸液、納米晶混懸液、含吐溫80的普通乳為對(duì)照,比較了各制劑在模擬胃液和模擬腸液中的釋藥速率。模擬胃腸液的狀態(tài)變化:乳液與模擬胃液分別以1:5、1:50的比例混合,37℃振蕩1 h后調(diào)節(jié)pH為7.5,并加入膽汁提取物和胰酶,37℃繼續(xù)振蕩。NSSPE與模擬胃液混合后樣品變清亮,且時(shí)間越長(zhǎng)、模擬胃液越多,清亮現(xiàn)象越明顯;粒徑、熒光顯微鏡和掃描電鏡(SEM)顯示,NSSPE與模擬胃液1:50接觸1 h后,乳滴表面的Pu綠色熒光圈變?nèi)?說明模擬胃液對(duì)NSSPE的乳滴結(jié)構(gòu)可能有一定的破壞。模擬胃液對(duì)含吐溫80的普通乳的影響較弱:外觀上看,僅1:50混合1 h后略變清亮,測(cè)得的粒徑、乳滴形態(tài)均無明顯變化。進(jìn)入腸液后,含吐溫80的普通乳和NSSPE呈現(xiàn)相似的變化;模擬腸液孵育2 h后,除觀察到球狀的乳滴外,兩種劑型都觀察到大量藥物結(jié)晶,藥物結(jié)晶的粒徑約為0.5-1μm。模擬胃腸液對(duì)含吐溫80的普通乳和NSSPE的zeta電位影響相同:進(jìn)入胃液后,zeta電位均顯著增大,1 h后的zeta電位分別從原始乳液的-46.0±2.36 mV和-39.9±0.5 mV,變?yōu)?.68±0.479 mV和-3.48±0.12 mV;進(jìn)入腸液后,zeta電位又都顯著降低,2 h后分別為-33.10±0.52 mV和-44.57±2.47 mV。藥物釋放:4種制劑中,原料藥混懸液、NCS、含吐溫80的普通乳和NSSPE在模擬胃液中240 min的累計(jì)釋放率分別為75.62±7.00%、99.30±2.48%、83.61±3.80%、80.97±0.90%,模擬腸液中240 min的累計(jì)釋放率分別為74.60±1.47%、97.19±2.82%、79.00±1.41%、76.54±3.44%。釋藥規(guī)律均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。NSSPE釋放慢于納米晶,證實(shí)納米晶在乳滴界面的吸附作用較強(qiáng)。(3)Pu 4種制劑的腸吸收動(dòng)力學(xué)采用大鼠單向腸灌流模型進(jìn)行腸吸收動(dòng)力學(xué)研究,高效液相色譜法測(cè)定灌流液中的Pu濃度。各制劑中的Pu在37℃的K-R液中3 h內(nèi)穩(wěn)定,腸段本身和蠕動(dòng)泵管道對(duì)制劑無物理吸附,證實(shí)大鼠單向腸灌流模型可用于Pu-NSSPE的腸吸收動(dòng)力學(xué)研究。Pu-NSSPE的K_a和P_(app)值按十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段的順序依次遞減,其中十二指腸顯著高于空腸和回腸(P0.05),極顯著高于結(jié)腸(P0.01),空腸和回腸間沒有顯著性差異。與其余3種制劑比較,NSSPE在各腸段的吸收均顯著高于原料藥混懸液和含吐溫80的普通乳:十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的P_(app)較原料藥混懸液分別提高了2.22、2.05、0.70、1.73倍,較含吐溫80的普通乳分別提高了2.77、0.38、0.57、0.70倍。與NCS比較,NSSPE在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段的P_(app)提高了2.14、0.74、0.34、0.43倍。4種制劑在整個(gè)小腸中的吸收順序?yàn)?NSSPENCS含吐溫80的普通乳原料藥混懸液。(4)體外細(xì)胞模型的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)分別以MDCK細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞模型,以Pu水溶液、含吐溫80的普通乳為對(duì)照,進(jìn)行了Pu-NSSPE的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),探討細(xì)胞攝取與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。MDCK細(xì)胞試驗(yàn):比較了不同濃度下Pu 3種制劑的細(xì)胞攝取率。結(jié)果顯示,在100-200μg·mL~(-1)濃度內(nèi),MDCK細(xì)胞對(duì)NSSPE的攝取率顯著高于溶液和含吐溫80的普通乳(P0.05)。100μg·mL~(-1)下的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示,NSSPE跨MDCK細(xì)胞的P_(app)也均顯著高于溶液組和含吐溫80的普通乳組(P0.05)。這表明,NSSPE較溶液和含吐溫80的普通乳更能促進(jìn)MDCK細(xì)胞對(duì)Pu的吸收。不同濃度的NSSPE的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示,NSSPE在100、150和200μg·mL~(-1)下的細(xì)胞攝取率較50μg·mL~(-1)分別提高了68.89%、101.04%和113.16%;但各濃度下的P_(app)之間無顯著差異,R_e在1.04-1.24之間。這說明,NSSPE跨MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。Caco-2細(xì)胞試驗(yàn):測(cè)定了Caco-2細(xì)胞對(duì)不同濃度的Pu-NSSPE、Pu水溶液和含吐溫80的Pu普通乳的細(xì)胞攝取率,同時(shí)用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察了100μg·mL~(-1)濃度下Caco-2細(xì)胞對(duì)尼羅藍(lán)標(biāo)記Pu后制備的3種制劑的攝取。結(jié)果顯示,50、100、150、200μg·mL~-11 4個(gè)濃度下Caco-2細(xì)胞對(duì)NSSPE的攝取率均顯著高于水溶液和含吐溫80的普通乳(P0.05);CLSM試驗(yàn)中,在細(xì)胞內(nèi)觀察到NSSPE較Pu水溶液、含吐溫80的普通乳具有更多的攝入量。加入不同抑制劑的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示,染料木素、吲哚美辛(小窩蛋白抑制劑)可顯著抑制Caco-2細(xì)胞對(duì)NSSPE的攝取,細(xì)胞攝取率分別較無抑制劑的對(duì)照組減少了25.46%和20.17%;聯(lián)合使用后細(xì)胞攝取率進(jìn)一步減少了33.46%;氯丙嗪(網(wǎng)格蛋白抑制劑)、阿米利洛(巨胞飲功能的抑制劑)與對(duì)照組相比無顯著差異。100μg·mL~(-1)下的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示,NSSPE組的P_(app)僅顯著高于水溶液組(P0.05),與含吐溫80的普通乳之間無顯著差異。不同濃度NSSPE的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示,隨著濃度從50μg·mL~(-1)增大到200μg·mL~(-1),NSSPE跨Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的通透速率逐漸增大,2 h時(shí)200μg·mL~(-1)組的AP→BL累積通透量較100、50μg·mL~(-1)組分別提高了1.99倍和3.90倍。NSSPE在100μg·mL~(-1)濃度下AP→BL和BL→AP方向的P_(app)分別為50μg·mL~(-1)組的1.26和1.57倍,但繼續(xù)增大濃度至200μg·mL~(-1),2個(gè)方向的P_(app)均未顯著增大(P0.05)。3個(gè)濃度下的R_e均大于1.5。以上結(jié)果表明,NSSPE跨Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)存在被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞攝取過程存在小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞,網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲這兩種吸收方式作用很小。以上研究結(jié)果再次表明,NSSPE較原料藥混懸液、NCS和含吐溫80的普通乳能更好的促進(jìn)Pu的口服吸收,尤其是NSSPE在十二指腸的吸收,這可能與十二指腸較強(qiáng)的酸性環(huán)境有關(guān);NSSPE促進(jìn)Pu口服吸收的機(jī)制與增強(qiáng)Pu的溶出無關(guān),其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)存在被動(dòng)和主動(dòng)2種機(jī)制,以及與小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)。
【圖文】：

matogram of puerarin standard (left), negative sample (middle) and Pu示，Pu 對(duì)照品的保留時(shí)間為 7.08 min，供試品溶液在 7，陰性樣品對(duì) Pu 的測(cè)量無干擾。說明該色譜條件專屬性范圍度 Pu 對(duì)照品溶液的色譜峰面積見表 1-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 137.969X + 2.7667，r=0.9999。可見，在 3.125-100 μg·mL峰面積的線性關(guān)系良好。表 1-1 Pu 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1-1 The standard curve of puerarin濃度/μg·mL-13.125 6.25 12.5 25 峰面積 120.8 235.2 455.5 963 19

圖 1-3 光學(xué)顯微鏡觀察的 Pu-NSSPE（A）和含吐溫 80 的普通乳（B）的乳滴形態(tài)Fig. 1-3 Droplet morphology of Pu-NSSPE (A) and surfactant emulsion (B) observed by lightmicroscopy由圖 1-3 可以看到 Pu-NSSPE 和含吐溫 80 的普通乳均有著較好的乳滴形態(tài)，有良好的球形形狀，分布較均勻，Pu-NSSPE 的粒徑約為 10 m 左右，含吐溫 80的普通乳粒徑較 NSSPE 小一些，約為 5 m 左右。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R283.6;R285.5

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本文編號(hào)：2669217