發(fā)布時間：2020-05-15 15:25

【摘要】：背景:硬皮病(scleroderma)是一種在病理上以纖維化為主要特征的特殊類型的結(jié)締組織病,在臨床上它的主要特點(diǎn)是局灶性或彌漫性皮膚增厚,輕者病變范圍較為局限,重者可累及多系統(tǒng)、多臟器纖維化,與自身免疫、纖維化和血管病變等密切相關(guān)。目前沒有明確有效的治療方案。經(jīng)前期觀察,基于中醫(yī)玄府理論、以補(bǔ)肺清瘀為主要治法而創(chuàng)制的補(bǔ)肺清瘀顆粒有一定的臨床療效,對于其現(xiàn)代藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及主要作用機(jī)制尚未完全闡明。研究目的:基于中醫(yī)玄府理論,以補(bǔ)肺清瘀為主要治法,分析研究補(bǔ)肺清瘀顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ);觀察補(bǔ)肺清瘀顆粒對硬皮病皮膚硬化的影響;應(yīng)用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析探索補(bǔ)肺清瘀顆粒治療硬皮病潛在的靶基因和相關(guān)蛋白,探討補(bǔ)肺清瘀顆粒治療硬皮病的作用機(jī)理,為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供新的科學(xué)證據(jù)。研究方法:1)運(yùn)用超高效液相色譜-四極飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometr,UHPLC-Q-TOF/MS)進(jìn)行補(bǔ)肺清瘀顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。制備供試品與標(biāo)準(zhǔn)品后,確定并選取合適的液相色譜、質(zhì)譜條件,采用UHPLC-Q-TOF/MS對該補(bǔ)肺清瘀顆粒復(fù)方中的代表性成分進(jìn)行定性及定量分析。2)將小鼠隨機(jī)分組,正常組、BLM模型組、BLM+補(bǔ)肺清瘀顆粒劑量組,采用給小鼠背部皮膚連續(xù)皮下注射博來霉素溶液4周復(fù)制硬皮病模型,每日灌服中藥28天后,分別觀察補(bǔ)肺清瘀顆粒對正常組、模型組和補(bǔ)肺清瘀顆粒組小鼠的不同治療效果,評估其小鼠的整體健康情況并計(jì)算各臟器指數(shù),另外,取皮膚組織對其進(jìn)行組織病理學(xué)分析,用堿水解法定量測定羥脯胺酸含量、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測定趨化因子(C-X-C基序)配體2(chemokine(C-X-C motif)ligand 2,Cxc12)含量、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)測定α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA),綜合觀察并評估補(bǔ)肺清瘀顆粒對硬皮病小鼠動物模型改善皮膚硬化的作用。3)分別取正常組、模型組和補(bǔ)肺清瘀顆粒組小鼠皮膚組織用Trizol法提取總RNA,RNA樣本質(zhì)檢合格后富集mRNA,繼而進(jìn)行mRNA文庫構(gòu)建并在Hiseq X Ten(Illumina)平臺上測序,隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,主要包括:測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及質(zhì)控,RNAseq測序評估,基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì),差異表達(dá)基因篩選,差異表達(dá)基因韋恩圖,差異表達(dá)基因可視化分析(火山圖),蛋白互做網(wǎng)絡(luò)分析,差異基因熱圖,Unigene注釋(GO注釋、KEGG注釋),差異基因GO富集分析,差異基因KEGG富集分析。采用條件為log2 Fold Change|1,p-value0.05并且至少有一組平均TPM值≥5篩選出差異基因,并選擇三個預(yù)測的靶基因用Quantitative real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證,然后,通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析差異基因,并篩選出相應(yīng)的信號通路,用Quantitative real-time PCR驗(yàn)證信號通路上相應(yīng)基因,此外,通過免疫印跡法驗(yàn)證相關(guān)蛋白以綜合探討補(bǔ)肺清瘀顆粒對博來霉素誘導(dǎo)小鼠硬皮病模型改善皮膚硬化的分子機(jī)制。研究結(jié)果:1)補(bǔ)肺清瘀顆粒中皂苷類成分主要來自黃芪、黨參、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸類成分主要來自丹皮、當(dāng)歸;丹參醌酮類成分主要來源于丹參;木脂素類成分在五味子中含量最高。2)與正常組比較,模型組小鼠雖然在不同時間點(diǎn)表現(xiàn)不完全相同,但總體趨勢顯示出精神萎靡,食量減少,蜷縮少動,體型減小,注射部位周圍毛發(fā)停止增長,皮膚變硬且厚,彈性差;脾指數(shù)顯著增加;羥脯胺酸含量明顯升高;病理上模型組出現(xiàn)了膠原纖維明顯增粗、數(shù)量增多、排列緊密、膠原間隙變窄、均質(zhì)化等改變以致真皮層明顯增厚,毛囊明顯減少,脂肪組織層變薄、消失,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象;Cxc12水平明顯升高;血管平滑肌陽性細(xì)胞數(shù)量增加。相較于模型組,補(bǔ)肺清瘀顆粒組小鼠精神尚可,取食、活動較多,皮膚硬化程度較輕;脾指數(shù)顯著減小;羥脯胺酸含量顯著降低;病理上看到膠原增生減少,真皮層厚度明顯減少,脂肪層變厚;Cxcl2水平明顯降低;血管平滑肌陽性細(xì)胞數(shù)量減少。3)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,篩選出差異基因,用Quantitative real-time PCR對靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,其中突觸體相關(guān)蛋白25(synaptosome associated protein 25,Snap25)和真核翻譯起始因子3,亞基J2(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J2,Eif3j2)的表達(dá)倍數(shù)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)一致,從一定程度上說明轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)是可靠性。通過KEGG通路分析篩選出信號通路,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路是位列前五的富集顯著差異基因的通路,此外,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上分別驗(yàn)證了Notch-1和Jagged-2,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)補(bǔ)肺清瘀顆�？梢燥@著降低Notch-1和Jagged-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。研究結(jié)論:補(bǔ)肺清瘀顆粒中代表性的化學(xué)成分主要有四大類,皂苷類成分主要來自黃芪、黨參、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸類成分主要來自丹皮、當(dāng)歸;丹參醌酮類成分主要來源于丹參;木脂素類成分在五味子中含量最高。補(bǔ)肺清瘀顆粒對博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型有保護(hù)作用,還可以預(yù)防脾腫大的發(fā)生并對免疫系統(tǒng)起到保護(hù)作用。而且,補(bǔ)肺清瘀顆粒在組織病理學(xué)和羥脯胺酸含量上都顯示出阻止皮膚硬化發(fā)展的趨勢,這機(jī)制部分可能是通過部分影響Cxcl2或中性粒細(xì)胞的參與、血管相關(guān)以及Notch信號通路等方面實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

邋ｍｉｎ逡逑圖３．１－１補(bǔ)肺清瘀顆粒中代表性化合物標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖（Ａ為正離子模式，Ｂ為負(fù)逡逑離子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氫丹參酮Ｉ邋；邋５、隱丹參酮；逡逑６、五味子甲素；７、丹參酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹參素；１０、毛蕊花糖苷；１１、阿逡逑魏酸；１２、黨參炔苷；１３、}P梗皂苷Ｄ；邋１４、黃芪甲苷。逡逑

邋ｍｉｎ逡逑３．１－２補(bǔ)肺清瘀顆粒水溶液中代表性化合物的提取離子流圖（Ａ為正離子模式，Ｂ為子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氫丹參酮Ｉ邋；邋５、隱丹參酮；逡逑五味子甲素；７、丹參酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹參素；１０、毛蕊花糖苷；１１、魏酸；１２、黨參炔苷；１３、桔梗皂苷Ｄ；邋１４、黃芪甲苷。逡逑利用ＴＯＦ／ＭＳ中準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比定性，，結(jié)果如１－２所示；補(bǔ)肺清瘀顆粒水溶液進(jìn)樣后，提取出的１４個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜峰如圖３．１－２，定量結(jié)果如表３．１－３所示。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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