【摘要】：目的本研究課題是國家“中藥復(fù)方多組分配伍篩選集成化微流控芯片的構(gòu)建及新藥篩選”“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(項(xiàng)目編號:2013ZX09507005-005)以及遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(項(xiàng)目編號:L201605)的一部分。本文基于微流控芯片技術(shù)探討荊芥黃酮誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用;分析荊芥黃酮組分的組成及配伍規(guī)律,并初步闡明荊芥黃酮誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制。為以藥理藥效為導(dǎo)向的質(zhì)量控制模式及抗肺腫瘤類新藥開發(fā)控制提供一定數(shù)據(jù)參考。方法1.采用軟光刻、模塑法以及等離子鍵合技術(shù)構(gòu)建一種用于體外抗肺腫瘤藥效學(xué)篩選的芯片,并采用熒光色素試劑對該芯片的性能進(jìn)行考察。2.在微流控芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上,以細(xì)胞凋亡壞死率(%)為考察指標(biāo),采用Hoechst33342/碘化丙啶(PI)雙染技術(shù)開展不同產(chǎn)地荊芥藥材及不同藥用部位黃酮類組分對人肺癌細(xì)胞A549的藥效學(xué)研究。3.采用高效液相色譜法進(jìn)行荊芥藥材黃酮類組分指紋圖譜的建立及含量檢測,灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件進(jìn)行譜效關(guān)系分析,HPLC-Q-TOF-MS對其藥效相關(guān)性成分進(jìn)行快速分析與鑒定,確定其藥效相關(guān)性化學(xué)成分。4.以凋亡壞死率(%)為檢測指標(biāo),對荊芥黃酮中藥效相關(guān)性成分進(jìn)行體外藥效學(xué)的研究,并采用均勻設(shè)計(jì)的方法篩選出其體外抗肺腫瘤作用的最佳配伍比例。5.采用Annexin V-FITC/PI雙染色法及PI單染色法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,探討荊芥黃酮誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549周期分裂及凋亡壞死的影響。6.采用PCR以及Western Blot等相關(guān)技術(shù),檢測荊芥黃酮對人肺癌A549細(xì)胞中Micro RNA以及相關(guān)基因及蛋白的相對表達(dá),雙重角度闡釋荊芥抗肺腫瘤的初步作用機(jī)制。結(jié)果1.本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并制作了一種雙層PDMS芯片。在第一PDMS薄膜層上集成有a、b、c、d、e、f、g、h共16個(gè)氣動微閥,其中aa1為一對配合使用,共8對;8個(gè)液閥,分別為液閥A、B、C、D、E、F、G、H;第二PDMS薄膜層上有細(xì)胞培養(yǎng)腔4×4列橢圓形結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的流體通道結(jié)構(gòu),四個(gè)模塊通過一個(gè)共用廢液口。測試結(jié)果顯示:集成有微閥結(jié)構(gòu)的微流控芯片液閥及氣閥均在72 h內(nèi)具有良好的閥控隔離能力;芯片中肺癌A549細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞存活率能達(dá)到98%以上,可用于后期實(shí)驗(yàn)研究。2.基于微流控芯片技術(shù)進(jìn)行荊芥黃酮類組分對人肺癌細(xì)胞A549的體外藥效結(jié)果顯示:荊芥黃酮類組分對人肺癌細(xì)胞均具有一定抑制作用,但作用強(qiáng)弱存在一定差異。在相同濃度和時(shí)間的條件下,安徽產(chǎn)地藥效最好,凋亡壞死率達(dá)到(67.40±3.56)%;廣東產(chǎn)地藥效最差,凋亡壞死率僅為(10.91±1.26)%。而同一荊芥植株不同藥用部位的體外藥效實(shí)驗(yàn)顯示其抗肺腫瘤的作用效果:葉根花莖。3.本研究基于高效液相色譜法建立了荊芥黃酮類組分的指紋圖譜,其中共有20個(gè)指紋色譜峰,通過相似度評價(jià)分析表明:不同產(chǎn)地藥材間相似度存在一定差異性。S1(安徽)、S2(甘肅)、S5(河南-商丘)、S7(湖北)、S8(四川)、S9(云南)為第一類,相似度均達(dá)到0.95以上;S6(河南-亳州)為第二類,相似度均達(dá)到0.85以上;S3(廣東)和S4(河北)為第三類,相似度僅為0.36左右;譜效關(guān)系分析結(jié)果顯示:20個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分與抗肺腫瘤作用有較高的關(guān)聯(lián)性,順序從強(qiáng)到弱依次為:19th6th10th12th20th16th11th18th,初步鑒定6種單體化學(xué)成分分別為槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香葉木素、木犀草素、木犀草苷。4.采用高效液相色譜法對9種不同產(chǎn)地荊芥藥材中關(guān)聯(lián)系數(shù)較大的6種化學(xué)成分進(jìn)行含量檢測,其中總黃酮含量分別在7.58 mg·g-1至17.91 mg·g-1范圍內(nèi),其中安徽產(chǎn)地含量最高。根據(jù)其含量檢測結(jié)果9種產(chǎn)地荊芥藥材聚類分析共聚為3類,安徽產(chǎn)地藥材為第一類,河南-商丘與廣東產(chǎn)地藥材聚為第二類,其余6種產(chǎn)地藥材聚為第三類。5.6種單體成分在相同濃度的條件下,作用效果木犀草苷槲皮苷木犀草素芹菜素香葉木素橙皮苷;均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:12個(gè)配伍組均具有一定誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用,凋亡壞死率在(27.68±1.674)%-(81.00±5.154)%之間。其中配伍三效果最佳;進(jìn)而推測出木犀草素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香葉木素按照3.06:2.90:2.04:4.17:0.12:2.75的比例配伍藥效最佳。6.通過流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:荊芥黃酮類組分及單體成分均具有一定誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用,其中最佳配伍組作用最強(qiáng)凋亡壞死率為(67.9±1.2)%,荊芥黃酮高劑量組作用次之,凋亡壞死率可達(dá)到(52.5±0.7)%。其余各給藥組強(qiáng)弱依次排序?yàn)?木犀草苷槲皮苷木犀草素荊芥黃酮中劑量組芹菜素香葉木素橙皮苷荊芥黃酮低劑量組。此外,尚能顯著抑制人肺癌細(xì)胞的分裂,抑制肺癌細(xì)胞G0/G1期及S期,X椉覵期細(xì)胞比例從而延緩腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。7.PCR檢測結(jié)果顯示:荊芥黃酮作用于人肺癌細(xì)胞A549后,干預(yù)PI3K-AKT信號通路中部分關(guān)鍵分子的表達(dá),micro RNA 126(mi R-126)和PTEN的表達(dá)上調(diào),VEGF和PI3K的表達(dá)下調(diào);6種單體成分及最佳配伍組中PTEN表達(dá)上調(diào),VEGF和PI3K表達(dá)下調(diào)。8.Western Blot檢測結(jié)果顯示:荊芥黃酮作用于人肺癌細(xì)胞A549后,干預(yù)PI3K-AKT信號通路中部分關(guān)鍵分子的表達(dá)。不同程度的降低了VEGF、AKT、Bcl-2及Cyclin B1蛋白的相對表達(dá),增加了PTEN及PI3K蛋白的相對表達(dá);6種單體成分及最佳配伍組降低了AKT和Cyclin B1蛋白的相對表達(dá),木犀草素能降低PI3K的表達(dá),芹菜素、香葉木素以及橙皮苷能增加PI3K的表達(dá)。除橙皮苷和最佳配伍組外,均能增加PTEN的表達(dá)、降低Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種用于抗肺腫瘤藥效篩選的微流控芯片,以滿足目前的實(shí)驗(yàn)需求。并憑借其操作靈活簡單、實(shí)驗(yàn)成功率高、結(jié)果穩(wěn)定、制作成本低等優(yōu)勢成功應(yīng)用于不同產(chǎn)地荊芥和不同藥用部位的體外藥效學(xué)研究。2.基于微流控芯片技術(shù)的體外藥效試驗(yàn)研究結(jié)果表明:由于產(chǎn)地不同所處的氣候以及環(huán)境不同,對化學(xué)成分的分布造成一定影響,導(dǎo)致不同產(chǎn)地荊芥藥材黃酮類組分體外抗肺腫瘤作用存在一定差異。其中安徽為荊芥藥材主產(chǎn)地之一,其效果較佳;不同藥用部位藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示根部也具有一定誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,所以根入藥可以擴(kuò)大藥用。所以針對不同產(chǎn)地以及不同藥用部位的研究可為荊芥藥材作為抗肺腫瘤類藥物治療的開發(fā)及合理利用提供一定理論依據(jù)。3.本研究通過高效液相色譜法以及灰色關(guān)聯(lián)度軟件得到荊芥黃酮類組分整體特征指紋圖譜和藥效貢獻(xiàn)度較大的色譜峰,在此基礎(chǔ)上并對其進(jìn)行了多指標(biāo)成分的含量檢測。該方法穩(wěn)定、可行,進(jìn)一步為荊芥藥材的質(zhì)量控制以及評價(jià)體系提供一定的參考價(jià)值。4.本研究基于微流控芯片技術(shù)初步完成了荊芥黃酮類組分中6種單體成分的配伍規(guī)律研究,其結(jié)果顯示:不同單體成分體外抗肺腫瘤作用存在一定差異,進(jìn)一步說明各化學(xué)成分混合在一起所發(fā)生的藥效結(jié)果并不是單體藥效的簡單疊加,此次均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出的最佳配伍比例效果優(yōu)于同等劑量的荊芥黃酮總組分,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期聯(lián)合用藥的深入研究奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。5.荊芥黃酮類組分、單體黃酮成分以及最佳配伍組在一定濃度范圍內(nèi),均具有一定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分裂的作用,但是其作用點(diǎn)有所不同,荊芥黃酮作用于S期較顯著,單體成分作用于G0/G1期、S期、G2/M期各異。說明單體成分相互作用部分協(xié)同增加抑制S期分裂,部分拮抗作用于G0/G1期和G2/M期。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了中藥多靶點(diǎn)的作用理念,說明中藥發(fā)揮療效是多種化學(xué)組分協(xié)同作用的結(jié)果。6.荊芥黃酮化學(xué)成分復(fù)雜,一方面,各給藥組均不同程度地上調(diào)抑癌基因PTEN的表達(dá),從而干擾PI3K/AKT信號通路,導(dǎo)致了PI3K以及VEGF下調(diào),進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。另一方面,mi R126在PI3K/AKT以及VEGF兩條信號通路中具有重要作用,VEGF是已經(jīng)被證實(shí)的mi R-126的作用靶點(diǎn),荊芥黃酮干預(yù)了相關(guān)蛋白的表達(dá),參與了機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。揭示出荊芥黃酮干預(yù)肺腫瘤細(xì)胞作用的重要途徑,明確了荊芥黃酮體外抗肺腫瘤作用的初步作用機(jī)制。7.荊芥黃酮作用于PI3K-AKT信號通路,并且調(diào)控了相關(guān)蛋白的表達(dá),值得注意的是:并非一種基因調(diào)控對應(yīng)的一種蛋白。對于周期蛋白(Cyclin B1)不同給藥組均具有一定作用。而凋亡蛋白(Bcl-2)只有配伍組作用不顯著。初步推斷荊芥發(fā)揮抗肺腫瘤的作用是各成分綜合調(diào)控共同作用的結(jié)果,并不是簡單的機(jī)制累積。
【圖文】：

圖 1-1-1 芯片的示意圖Fig.1-1-1 Schematic diagram of the chip.2 芯片的制作本實(shí)驗(yàn)采用 CorelDRAW X6 繪制該芯片的圖形結(jié)構(gòu)文件，并將其打印成光刻掩膜

-2芯片的實(shí)物圖
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 樊佳新;王帥;孟憲生;包永睿;李天嬌;;基于微流控芯片技術(shù)的荊芥誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞凋亡譜效關(guān)系研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

2 李雪飛;江洪;;橙皮苷藥理學(xué)作用機(jī)制及研究進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2016年14期

3 王月華;李愛峰;付崇羅;張麗;劉紅英;玄紅專;;木犀草素抗腫瘤活性研究[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2016年07期

4 于雪;辛瑩娟;蔣緒;;色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代鹽化工;2016年03期

5 龔錦;周宇;涂亞庭;林能興;;微小RNA-126與血管內(nèi)皮生長因子mRNA在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用[J];臨床皮膚科雜志;2016年04期

6 張?jiān)?王火;牛聰;曹波;陳虹;;多靶點(diǎn)鬼臼毒素新衍生物CCP-1抗腫瘤多藥耐藥作用機(jī)制研究[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2016年01期

7 馬聰;王帥;孟憲生;包永睿;;基于灰色關(guān)聯(lián)度分析的荊芥抗Caco-2細(xì)胞總黃酮純化工藝研究[J];中草藥;2015年11期

8 馬聰;包永睿;孟憲生;王帥;;基于層次分析和量效對比法優(yōu)選荊芥總黃酮提取工藝[J];中藥材;2015年02期

9 楊琳;;槲皮苷藥理活性研究進(jìn)展[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2015年06期

10 薛碧君;孫大興;;中醫(yī)藥治療非小細(xì)胞肺癌研究進(jìn)展[J];浙江中醫(yī)雜志;2015年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 魚強(qiáng)花;超聲提取小魚仙草總黃酮的動力學(xué)模型及其工藝優(yōu)化[D];陜西師范大學(xué);2014年

2 王心喜;萬年蒿抗腫瘤活性與化學(xué)成分研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 夏飛;PDMS微流控芯片的制備工藝研究[D];南京理工大學(xué);2010年

4 趙龍;流動介質(zhì)中微流控芯片體系肺癌細(xì)胞耐藥性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2009年

5 汪鵬;PDMS在微流控生物芯片技術(shù)中的新型應(yīng)用[D];上海交通大學(xué);2009年

，

本文編號：2664319