【摘要】：目的:研究化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)大鼠腎臟損傷的干預作用,并探討其作用機制是否與調控腎組織Notch和Hedgehog(Hh)通路的激活有關。方法:60只健康雄性SD大鼠,隨機選取10只作為正常組(C組),50只為造模組。造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量(35 mg/kg)鏈脲佐菌素(streptozotion,STZ)腹腔注射以建立糖尿病大鼠模型。成模大鼠隨機分為模型組(M組)、化瘀通絡中藥組(Q組)和厄貝沙坦組(I組)。Q組和I組分別給予相應藥物灌胃,C組和M組予相應體積的純凈水灌胃,連續(xù)灌胃16周。期間定期監(jiān)測血糖、飲水量、進食量、尿量、24h尿蛋白定量;于第16周末大鼠稱重,麻醉后留取血、尿標本,取右腎稱重,留取腎組織標本,采用光鏡、電鏡進行病理學觀察;采用免疫組織化學(immunohistochemistry technique,IHC)、實時定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印跡法(Western Blot)對Notch和Hh信號通路中相關蛋白及m RNA表達進行檢測。結果:1化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠“瘀血阻絡證”的干預作用1.1大鼠一般狀況C組大鼠一般狀況良好,糖尿病(diabetes mellitus,DM)造模成功后,M、Q、I組大鼠出現不同程度的毛色晦暗、反應遲鈍、舌色爪色紫暗等癥狀,于第12周部分大鼠出現膿瘡等并發(fā)癥。于第12周開始,各治療組大鼠與模型組相比,上述癥狀有不同程度減輕。1.2隨機血糖和血脂水平與C組相比,各造模組大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高(P0.01)。而與M組相比,化瘀通絡中藥組大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低(P0.01)。各造模組大鼠的隨機血糖值,組間比較未見統(tǒng)計學差異(P0.05)。1.3 24小時尿蛋白定量檢測結果從干預第4周末開始,與C組對比,各造模組大鼠24小時尿蛋白定量均明顯上升(P0.01);但于第12周和16周末,與M組對比,Q組和I組大鼠的24小時尿蛋白定量均明顯降低(P0.01);于第16周末,Q組較I組明顯降低(P0.01)。1.4血凝指標檢測結果與C組比較,各造模組大鼠血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶時間(thrombin time,TT)均明顯縮短(P0.05或P0.01),國際標準化比值(international standardization ratio,INR)明顯減小(P0.01),血漿纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)水平明顯升高(P0.01)。與M組比較,Q組大鼠PT、INR和APTT均明顯增大(P0.05或P0.01),I組無明顯差異(P0.05)。在TT和FIB方面,各造模組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。2化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠腎臟損傷的干預作用2.1腎臟肥大指數比較與C組對比,各造模組大鼠腎臟肥大指數明顯升高(P0.01);而與M組對比,Q組DKD大鼠的腎臟肥大指數明顯降低(P0.01)。2.2光鏡及透射電鏡觀察結果光鏡觀察可見各造模組大鼠出現不同程度的腎小球體積增大,腎小囊腔隙狹窄,腎小球基底膜增厚,系膜基質增多,腎小管上皮細胞腫脹;電鏡可見基底膜不規(guī)則性增厚,足突部分融合;而各治療組病理改變較模型組有不同程度減輕。2.3腎功能檢測與C組對比,各造模組大鼠血肌酐、尿素氮及尿酸水平均顯著升高(P0.01);與M組對比,Q組大鼠的血肌酐和血尿酸水平顯著降低(P0.01)。3化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠腎組織Notch通路表達的干預作用3.1 Real-time PCR檢測腎組織Notch1、Jagged1、HES1和Hey1 m RNA表達與C組對比,各造模組大鼠腎皮質Notch1、Jagged1、HES1和Hey1m RNA表達量明顯升高(P0.01);與M組對比,Q組和I組大鼠Notch1、Jagged1、HES1和Hey1 m RNA表達量均明顯減少(P0.01);與I組對比,Q組大鼠HES1 m RNA表達量明顯減少(P0.01)。3.2免疫組化法檢測腎組織Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白表達Notch1蛋白陽性信號主要定位于腎小球固有細胞、腎小管上皮細胞的胞漿,呈黃色或棕黃色顆粒狀;Hey1蛋白陽性信號主要定位于腎小球固有細胞、腎小管上皮細胞的細胞核和/或胞漿;HES1蛋白陽性信號主要定位于腎小球固有細胞、腎小管上皮細胞的細胞核;Jagged1蛋白陽性信號主要定位于腎小管上皮細胞的胞漿。Notch1、HES1、Hey1和Jagged1蛋白于C組大鼠有少量表達,M組表達明顯增多,Q組和I組較M組有所減少。3.3 Western Blot檢測腎皮質中Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白表達與C組對比,各造模組大鼠Notch1、Hey1、HES1和Jagged1蛋白的表達量均明顯增多(P0.01);與M組對比,Q組和I組大鼠Notch1、Hey1、HES1和Jagged1蛋白的表達量均明顯減少(P0.01);與I組對比,Q組Hey1和HES1兩種蛋白表達量明顯減少(P0.01)4化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠腎組織Hh通路表達的干預作用4.1免疫組化檢測各組大鼠腎組織GLI1、SHH、FSP1、LN蛋白結果GLI1、SHH、FSP1和LN蛋白的陽性信號均定位于腎小管上皮細胞的胞漿,呈黃色或棕黃色顆粒狀。C組大鼠GLI1、SHH、FSP1、LN蛋白表達微弱,M組大鼠表達明顯增多,Q組和I組表達量較M組有所減少。4.2 Real-time PCR檢測腎組織GLI1、SHH、FSP1 m RNA表達與C組比較,各造模組大鼠GLI1、SHH、FSP1 m RNA表達均明顯增多(P0.01);在SHH m RNA表達方面,與M組比較,Q組和I組表達量均降低(P0.05),Q組和I組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。在GLI1和FSP1 m RNA表達方面,與M組比較,Q組和I組表達量均降低(P0.01);與Q組比較,I組表達量增加(P0.05或P0.01)。4.3 Western Blot檢測各組大鼠腎組織GLI1、SHH、FSP1蛋白結果與C組對比,各造模組大鼠GLI1、SHH、FSP1蛋白的表達量均明顯增多(P0.01);與M組對比,Q組和I組大鼠GLI1、SHH、FSP1蛋白的表達量均明顯減少(P0.01);與I組對比Q組GLI1、SHH、FSP1蛋白表達量明顯降低(P0.01)。結論:1.模型大鼠血糖升高后逐漸出現蛋白尿及DKD腎臟病理改變,提示DKD模型復制成功。且模型大鼠存在糖脂代謝紊亂,血液處于高凝狀態(tài),出現典型的血瘀癥狀,符合中醫(yī)瘀血阻絡證改變。2.化瘀通絡中藥能明顯改善DKD大鼠瘀血阻絡狀態(tài),降低大鼠尿蛋白,減輕腎臟病理損傷,對大鼠腎臟有明顯的保護作用。3.化瘀通絡中藥能夠抑制Notch通路Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白的高表達,這可能是其減少尿蛋白排泄,減輕腎臟損傷的作用機制之一。4.化瘀通絡中藥能明顯抑制Hh通路的部分活化,從而減少FSP1和LN的表達,這可能是其減輕腎小管損傷和腎間質纖維化的重要途徑之一。
【圖文】：

-1 化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠不同時間點隨機血糖的[mmol/L, (x )]1-1 Effects of Huayu Tongluo herbs on random blood glucose (Rith diabetic kidney disease at different time points [mmol/L, (xcontrol; M, model; Q, Huayu Tongluo herbs; I, irbesartan)

化瘀通絡中藥對糖尿病腎臟病大鼠不同時間點隨機[mmol/L, (x )]1 Effects of Huayu Tongluo herbs on random blood glth diabetic kidney disease at different time points [mmcontrol; M, model; Q, Huayu Tongluo herbs; I, irbes
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2664161