【摘要】：蒲公英屬(Taraxacum)植物是臨床常用的中藥材,是一種藥食同源的植物。蒲公英味苦、甘,性寒,蒲公英因為其具有利膽、利尿和抗炎等藥用效果所以長期以來作為藥用。巨噬細胞作為先天免疫細胞,在巨噬細胞保護身體免受外來入侵者的侵襲吞噬時引發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答。當(dāng)受到脂多糖(LPS)刺激時,巨噬細胞被激活并釋放多種促炎因子和細胞因子,其過度釋放可能導(dǎo)致廣泛的組織損傷和病理改變。在此過程中,巨噬細胞產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)如白細胞介素(IL)-6,腫瘤腫瘤壞死因子(TNF)-α、一氧化氮(NO)、前列腺素。產(chǎn)生過多的介質(zhì)導(dǎo)致的各種生理障礙,包括腫瘤形成,自身免疫性反應(yīng)與炎癥性疾病。LPS是一種有效的單核細胞和巨噬細胞的誘導(dǎo)劑,是天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵介質(zhì)。由LPS刺激RAW264.7巨噬細胞導(dǎo)致細胞內(nèi)信號傳遞,最終導(dǎo)致細胞因子和其他炎癥介質(zhì)構(gòu)成促炎性介質(zhì)的生產(chǎn)和分泌。因此本研究以LPS誘導(dǎo)巨噬細胞作為體外炎癥模型。為提高蒲公英的藥用和食用價值,進一步加大蒲公英的綜合利用,本文對蒲公英醇提物、以及純化了的糖蛋白和皂苷的抗炎作用進行了深入研究。通過利用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞為體外細胞炎癥模型,研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在體外抗炎活性,并采用MTT法檢測其對RAW264.7細胞的增殖毒性,Griess reagent法檢測了NO的分泌情況,RT-PCR檢測炎癥細胞因子白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α以及iNOS mRNA的表達水平,ELISA測定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot檢測IκB-α蛋白的磷酸化水平,用以研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。結(jié)果顯示,蒲公英醇提物在(0-5.0mg/mL)、蒲公英糖蛋白在(0-1.0mg/mL)、蒲公英皂苷在(0-1.0mg/mL)范圍內(nèi)均對細胞的增殖活性無明顯作用。RT-PCR結(jié)果表明,不同濃度的蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷均抑制了TNF-α、IL-6和iNOSmRNA的表達,又通過ELISA試驗驗證了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能夠抑制TNF-α和IL-6的分泌,這與mRNA的表達結(jié)果一致,并呈劑量依賴性。另外,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷還能抑制NO的合成。以上實驗數(shù)據(jù)表明,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在體外實驗中能夠通過調(diào)節(jié)細胞因子和炎性介質(zhì)的分泌而發(fā)揮抗炎作用。我們又進一步對分析了LPS誘導(dǎo)的細胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生機制發(fā)現(xiàn),在炎癥信號通路中,最常見的信號通路NF-κB起了關(guān)鍵作用。本實驗通過利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞,測定了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷對NF-κB信號通路的影響。結(jié)果顯示,LPS可顯著上調(diào)IκB-α的磷酸化水平,而蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能呈劑量依賴性的抑制IκB-α蛋白磷酸化水平,從而間接的證明了其能夠通過調(diào)控NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制TNF-α和IL-6的分泌和TNF-α、IL-6和iNOS mRNA的表達以及NO的合成,從而發(fā)揮其抗炎作用。本研究證明了蒲公英醇提物具有抗炎效果,且醇提物中的糖蛋白和皂苷也起到了抗炎作用,并首次發(fā)現(xiàn)和證明了蒲公英糖蛋白在細胞炎癥因子方面的抗炎分子機制,這不僅為蒲公英抗炎機制提供了依據(jù),而且還為糖蛋白的抗炎分子機制研究提供了新的思路,同時也為開發(fā)蒲公英抗炎產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

為篩選出蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷對RAW264.7細胞的最適濃度，采用MTT比色法檢測RAW264.7細胞的增殖活性，將不同濃度的蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷與RAW264.7細胞共同孵育24h。具體實驗分組及結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果如圖 1所示，每組與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。這表明蒲公英醇提物濃度在0-5.0mg/mL 的范圍內(nèi)，蒲公英糖蛋白濃度在 0-1.0mg/mL 的范圍內(nèi)，蒲公英糖皂苷濃度在 0-1.0m g/mL 的范圍內(nèi)，對 Raw 264.7細胞是沒有毒性作用的。3.2 蒲公英提取物對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細胞合成 NO 的影響根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取蒲公英醇提物的劑量分組為625，1250，2500μg/mL

3.3 蒲公英提取物對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細胞炎癥因子表達的影響3.3.1 蒲公英醇提物對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細胞炎癥因子表達的影響由圖3可以看出，，100ng/mL的LPS單獨作用RAW264.7巨噬細胞24h后與空白對照組相比較，能極顯著的上調(diào)IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表達水平（P<0.01）。蒲公英醇提物與RAW264.7細胞共同孵育24h后，與LPS對照組相比，低、中、高劑量組均能顯著或極顯著的下調(diào)IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表達水平（P<0.05，P<0.01）且呈劑量依賴關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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