【摘要】：蒲公英屬(Taraxacum)植物是臨床常用的中藥材,是一種藥食同源的植物。蒲公英味苦、甘,性寒,蒲公英因?yàn)槠渚哂欣�、利尿和抗炎等藥用效果所以長(zhǎng)期以來(lái)作為藥用。巨噬細(xì)胞作為先天免疫細(xì)胞,在巨噬細(xì)胞保護(hù)身體免受外來(lái)入侵者的侵襲吞噬時(shí)引發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答。當(dāng)受到脂多糖(LPS)刺激時(shí),巨噬細(xì)胞被激活并釋放多種促炎因子和細(xì)胞因子,其過(guò)度釋放可能導(dǎo)致廣泛的組織損傷和病理改變。在此過(guò)程中,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL)-6,腫瘤腫瘤壞死因子(TNF)-α、一氧化氮(NO)、前列腺素。產(chǎn)生過(guò)多的介質(zhì)導(dǎo)致的各種生理障礙,包括腫瘤形成,自身免疫性反應(yīng)與炎癥性疾病。LPS是一種有效的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)劑,是天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵介質(zhì)。由LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,最終導(dǎo)致細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)構(gòu)成促炎性介質(zhì)的生產(chǎn)和分泌。因此本研究以LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞作為體外炎癥模型。為提高蒲公英的藥用和食用價(jià)值,進(jìn)一步加大蒲公英的綜合利用,本文對(duì)蒲公英醇提物、以及純化了的糖蛋白和皂苷的抗炎作用進(jìn)行了深入研究。通過(guò)利用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞為體外細(xì)胞炎癥模型,研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在體外抗炎活性,并采用MTT法檢測(cè)其對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖毒性,Griess reagent法檢測(cè)了NO的分泌情況,RT-PCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α以及iNOS mRNA的表達(dá)水平,ELISA測(cè)定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot檢測(cè)IκB-α蛋白的磷酸化水平,用以研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷對(duì)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。結(jié)果顯示,蒲公英醇提物在(0-5.0mg/mL)、蒲公英糖蛋白在(0-1.0mg/mL)、蒲公英皂苷在(0-1.0mg/mL)范圍內(nèi)均對(duì)細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯作用。RT-PCR結(jié)果表明,不同濃度的蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷均抑制了TNF-α、IL-6和iNOSmRNA的表達(dá),又通過(guò)ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能夠抑制TNF-α和IL-6的分泌,這與mRNA的表達(dá)結(jié)果一致,并呈劑量依賴性。另外,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷還能抑制NO的合成。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在體外實(shí)驗(yàn)中能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的分泌而發(fā)揮抗炎作用。我們又進(jìn)一步對(duì)分析了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)制發(fā)現(xiàn),在炎癥信號(hào)通路中,最常見(jiàn)的信號(hào)通路NF-κB起了關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞,測(cè)定了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示,LPS可顯著上調(diào)IκB-α的磷酸化水平,而蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能呈劑量依賴性的抑制IκB-α蛋白磷酸化水平,從而間接的證明了其能夠通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制TNF-α和IL-6的分泌和TNF-α、IL-6和iNOS mRNA的表達(dá)以及NO的合成,從而發(fā)揮其抗炎作用。本研究證明了蒲公英醇提物具有抗炎效果,且醇提物中的糖蛋白和皂苷也起到了抗炎作用,并首次發(fā)現(xiàn)和證明了蒲公英糖蛋白在細(xì)胞炎癥因子方面的抗炎分子機(jī)制,這不僅為蒲公英抗炎機(jī)制提供了依據(jù),而且還為糖蛋白的抗炎分子機(jī)制研究提供了新的思路,同時(shí)也為開(kāi)發(fā)蒲公英抗炎產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

為篩選出蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞的最適濃度，采用MTT比色法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性，將不同濃度的蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷與RAW264.7細(xì)胞共同孵育24h。具體實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1所示，每組與空白組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明蒲公英醇提物濃度在0-5.0mg/mL 的范圍內(nèi)，蒲公英糖蛋白濃度在 0-1.0mg/mL 的范圍內(nèi)，蒲公英糖皂苷濃度在 0-1.0m g/mL 的范圍內(nèi)，對(duì) Raw 264.7細(xì)胞是沒(méi)有毒性作用的。3.2 蒲公英提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞合成 NO 的影響根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取蒲公英醇提物的劑量分組為625，1250，2500μg/mL

3.3 蒲公英提取物對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響3.3.1 蒲公英醇提物對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響由圖3可以看出，，100ng/mL的LPS單獨(dú)作用RAW264.7巨噬細(xì)胞24h后與空白對(duì)照組相比較，能極顯著的上調(diào)IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表達(dá)水平（P<0.01）。蒲公英醇提物與RAW264.7細(xì)胞共同孵育24h后，與LPS對(duì)照組相比，低、中、高劑量組均能顯著或極顯著的下調(diào)IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01）且呈劑量依賴關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2662336