【摘要】：肝臟不僅是人體最重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝器官,還是許多非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如藥物、毒物以及有毒代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化器官,因此肝臟也被稱(chēng)為解毒器官。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明肝臟也是人體重要的免疫器官,肝臟中還包括種類(lèi)多樣的免疫細(xì)胞,如kupffer細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等,肝竇內(nèi)皮細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞也具有免疫功能。肝損傷是指在多種致病因素侵害肝臟導(dǎo)致肝細(xì)胞損害,肝臟功能受損,導(dǎo)致肝臟不能發(fā)揮正常功能,進(jìn)而引發(fā)一系列癥狀,甚至引起死亡。常見(jiàn)的致病因素包括病毒、細(xì)菌、藥物、化學(xué)毒物以及酒精等。臨床上常見(jiàn)藥物性肝炎和免疫性肝炎等,肝炎急性發(fā)作容易導(dǎo)致急性肝衰竭,肝臟代償功能不足時(shí)容易引起死亡,肝移植是最好的治療方法,但由于供體不足往往延誤治療時(shí)機(jī),最終失去生命,因此肝衰竭的預(yù)防和治療是一個(gè)亟需解決的難題,尋找治療急性肝損傷的有效藥物具有重要的臨床意義。對(duì)乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥,過(guò)量服用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝壞死,但肝壞死的機(jī)制仍需要深入的研究。本研究采用腹腔注射APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷,在禁食的前提下200 mg·kg-1的APAP導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)輕度的肝損傷,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的輕度升高以及肝細(xì)胞腫脹,300 mg·kg-1的APAP導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)重度的肝損傷,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶顯著升高以及嚴(yán)重的肝壞死。輕度損傷肝組織與正常肝組織相比有36個(gè)差異蛋白,其中有24個(gè)上調(diào)和12個(gè)下調(diào);壞死肝組織與正常肝組織相比有44個(gè)差異蛋白,其中有32個(gè)上調(diào)和12個(gè)下調(diào)。對(duì)44個(gè)差異蛋白進(jìn)行分析表明下調(diào)的蛋白主要是抗氧化蛋白和解毒酶等保護(hù)性蛋白,上調(diào)的蛋白包括損傷壞死以及修復(fù)相關(guān)的蛋白,準(zhǔn)確的區(qū)分損傷壞死與修復(fù)相關(guān)因子對(duì)于AILI的臨床治療具有重要的意義。進(jìn)一步采用免疫組化對(duì)上調(diào)的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定,結(jié)果表明Hsp70與PCNA表達(dá)一致,是肝臟修復(fù)再生相關(guān)蛋白;p-Stat3和PCNA、Hsp70表達(dá)一致僅在輕度損傷和修復(fù)區(qū)域的肝細(xì)胞表達(dá),在壞死肝組織基本不表達(dá),表明p-Stat3代表肝細(xì)胞修復(fù)再生;Stat3主要在肝壞死區(qū)域表達(dá),與Hsp70和p-Stat3的表達(dá)完全不同,表明Stat3與肝壞死相關(guān),同時(shí)還說(shuō)明差異蛋白中顯著上調(diào)的的Stat3主要是本底型Stat3;在損傷修復(fù)期Stat3向P-Stat3的轉(zhuǎn)換體現(xiàn)了肝細(xì)胞的從死亡到再生的過(guò)程,此時(shí),大量的巨噬細(xì)胞聚集在原來(lái)壞死組織處,我們推測(cè)Stat3可能是一個(gè)DAMP分子吸引巨噬細(xì)胞來(lái)清除壞死組織。免疫組化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)肝組織中過(guò)表達(dá)的P4hα1、Ncam、α-SMA和Cygb可能參與肝臟修復(fù),它們不僅僅是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物也可能代表肝細(xì)胞從損傷壞死到再生的一種中間狀態(tài);Hsp70、p-Stat3、Ncam、α-SMA和c-kit在輕度損傷的靜脈周肝細(xì)胞表達(dá),表明這群肝細(xì)胞在遇到毒性刺激等損傷因素時(shí)具有自我修復(fù)能力。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)合免疫組化驗(yàn)證展示了AILI損傷以及修復(fù)的機(jī)制以及影響因素,包括氧化還原系統(tǒng)的破壞以及壞死和修復(fù)再生相關(guān)因子的上調(diào),其中本底型Stat3的累積可能與肝壞死相關(guān),Hsp70和Stat3的活化與修復(fù)再生相關(guān),P4hα1、Ncam、α-SMA和Cygb的表達(dá)表明肝細(xì)胞在肝損傷修復(fù)中的發(fā)揮主要作用。巨噬細(xì)胞在AILI肝損傷中的作用不僅通過(guò)吞噬作用清除壞死細(xì)胞碎片,還通過(guò)分泌和釋放IL-6激活Stat3和Hsp70促進(jìn)肝臟再生,并促進(jìn)P4h等的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù),因此抑制巨噬細(xì)胞的功能將不利于AILI的治療。刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型是研究免疫性肝炎以及預(yù)測(cè)藥物治療效果的常用動(dòng)物模型。本研究采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝炎模型的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。在上調(diào)的蛋白中Adrm1會(huì)激活去泛素化酶Uch37導(dǎo)致泛素釋放增加,Isg15會(huì)占據(jù)泛素結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致泛素應(yīng)激,泛素應(yīng)激激活P62介導(dǎo)的選擇性自噬,Isg15和ISG化蛋白也通過(guò)P62介導(dǎo)的自噬進(jìn)行降解,Pkr和Atg7導(dǎo)致LC3 Ⅱ表達(dá)增加,上述一系列的因素導(dǎo)致自噬負(fù)荷的增加,溶酶體的降解能力受損則會(huì)導(dǎo)致自噬流的中斷,表現(xiàn)為P62和LC3 Ⅱ的累積。Stat1的上調(diào)表明是其介導(dǎo)了免疫系統(tǒng)的激活。免疫組化方法驗(yàn)證了 Stat1、Pkr、Atg7和Adrm1的上調(diào),并證明了P62和LC3Ⅱ的在壞死組織的累積,自噬體的累積導(dǎo)致了肝細(xì)胞的死亡。IFN-γ/Stat1信號(hào)通路介導(dǎo)了免疫性肝損傷。據(jù)報(bào)道,在IFN-γ存在的環(huán)境中IL-6也可以通過(guò)激活Stat1發(fā)揮促炎作用。結(jié)果表明IFNγ/IL-6/Stat1信號(hào)通路介導(dǎo)了富集在免疫系統(tǒng)進(jìn)程的蛋白表達(dá)的上調(diào),提示在免疫性肝損傷治療方面可以通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路減輕肝損傷。牛蒡子苷元是傳統(tǒng)中藥牛蒡子的主要活性成分,具有顯著的抗炎作用,研究表明牛蒡子苷元能夠抑制T淋巴細(xì)胞激活、抑制巨噬細(xì)胞炎癥、抑制IFNγ/Stat1和IL-6/Stat3信號(hào)通路,推測(cè)牛蒡子苷元可能對(duì)ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。結(jié)果表明牛蒡子苷元可以顯著降低ConA導(dǎo)致的小鼠死亡率,顯著減輕病理?yè)p傷和改善肝功能,效果與陽(yáng)性藥環(huán)孢素A和醋酸潑尼松相當(dāng)。牛蒡子苷元預(yù)處理可以顯著降低促炎因子IL-6和IFN-γ的水平、升高抗炎因子IL-10的水平。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示給藥組的肝組織與模型組相比有37個(gè)差異蛋白,其中有5個(gè)上調(diào),32個(gè)下調(diào),差異蛋白分析結(jié)果表明牛蒡子苷元預(yù)處理可以顯著降低富集在免疫系統(tǒng)進(jìn)程上的蛋白表達(dá)水平,免疫組化和蛋白電泳結(jié)果表明牛旁子苷元預(yù)處理可以降低Stat1、Pkr、Bnip3、Beclin1、Atg7、Adrm1、LC3B和P62的蛋白表達(dá),降低p-Stat1和p-Pkr的水平,RT-PCR分析結(jié)果表明牛蒡子苷元預(yù)處理顯著降低了 Stat1、Pkr和Atg7的基因表達(dá)。以上結(jié)果表明牛蒡子苷元可以通過(guò)抑制IFN-y/IL-6/Stat1和IL-6/Bnip3信號(hào)通路減輕ConA誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞自噬和凋亡。本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示了免疫系統(tǒng)激活引發(fā)的自噬失調(diào)在ConA誘導(dǎo)的肝炎中的作用,提出在免疫性肝炎的治療上自噬和凋亡同樣具有重要的臨床意義,牛蒡子苷元在治療免疫性肝炎方面具有潛在的價(jià)值。總之,本論文研究的意義在于采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)合免疫組化技術(shù)對(duì)AILI中損傷、壞死以及修復(fù)再生因素進(jìn)行了分析和鑒定,對(duì)ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究,通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行對(duì)比總結(jié)出參與兩種肝損傷的Stats成員不同、炎癥細(xì)胞作用不同,推測(cè)具有抗炎作用的牛蒡子苷元對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了牛蒡子苷元的治療效果,并初步闡明了牛蒡子苷元的肝臟保護(hù)作用機(jī)制,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道自噬也是病毒性肝炎的治療靶點(diǎn)和牛蒡子苷元的抗病毒作用,推測(cè)牛蒡子苷元可以應(yīng)用于病毒性肝炎合并自身免疫性肝炎的患者的治療,牛蒡子苷元對(duì)免疫性肝炎的保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。
【圖文】：

僅在ＡＩＨ患者的血清中檢測(cè)到ＩＬ－２和ＩＬ－１５的顯著增加［４６］。逡逑綜上所述，從ＡＩＨ患者血清和活檢的研宄中獲得的關(guān)于ＡＩＨ發(fā)病機(jī)制的了解可逡逑以被總結(jié)成圖１［４７］：外部觸發(fā)事件，例如病毒感染，在肝臟局部引發(fā)炎癥。先天免疫逡逑系統(tǒng)的肝臟駐留細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞）被激活并逡逑釋放第一波炎癥因子（細(xì)胞因子、趨化因子），這些炎癥因子又吸引和／或激活先天免疫逡逑系統(tǒng)的其他細(xì)胞以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞，包括Ｂ細(xì)胞和Ｔ細(xì)胞�？赡苡捎谝粋�(gè)或多個(gè)逡逑病毒抗原和肝臟自身抗原之間存在結(jié)構(gòu)相似性（分子模擬），或者由于在肝細(xì)胞損傷時(shí)逡逑暴露出隔離的“未知”自身抗原，導(dǎo)致特異性Ｂ和Ｔ細(xì)胞被激活和擴(kuò)增。隨后，通逡逑過(guò)肝細(xì)胞裂解（穿孔／顆粒酶Ｂ或補(bǔ)體介導(dǎo)的）或釋放細(xì)胞毒素（如ＩＦＮｙ和ＴＮＦａ）的機(jī)逡逑制，慢性破壞得以延續(xù)。逡逑１０逡逑

圖１肝細(xì)胞內(nèi)ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３在肝臟損傷炎癥和再生方面的調(diào)控作用ｌ２８ｌ肝細(xì)胞內(nèi)Ｓｔａｔｌ主要逡逑由ＩＦＮＹ激活，Ｓｔａｔ３主要由ＩＬ－邋６家族細(xì)胞因子激活。激活的Ｓｔａｔｌ二聚化并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與炎逡逑癥反應(yīng)、抑制肝細(xì)胞再生。而激活的Ｓｔａｔ３則可參與抑制炎癥、促進(jìn)肝臟再生。通常情況下，肝逡逑內(nèi)激活的Ｓｔａｔ３可以抑制Ｓｔａｔｌ信號(hào)傳導(dǎo)阻止肝臟炎癥發(fā)生。但Ｓｔａｔ３也可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝細(xì)胞產(chǎn)逡逑生急性期蛋白，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。肝細(xì)胞內(nèi)Ｓｔａｔｌ和Ｓｔａｔ３分別通過(guò)Ｓ０ＣＳ１和Ｓ０ＣＳ３蛋白抑制，，逡逑相互調(diào)控。（注：ＩＳＧ：干擾素刺激基因；ＧＡＳ：干擾素ｙ激活序列）逡逑以上研究證實(shí)了邋ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３復(fù)雜的生物學(xué)功能【５｜１，它們的異常表達(dá)可導(dǎo)逡逑致功能的改變，并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，比如會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病、各種感染的易感性逡逑或癌癥。通過(guò)對(duì)ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３的深入研究可以加強(qiáng)對(duì)肝病發(fā)病機(jī)制的了解，為進(jìn)逡逑一步開(kāi)發(fā)治療藥物奠定基礎(chǔ)，但仍需要更多的深入細(xì)致的基礎(chǔ)研宄以發(fā)現(xiàn)更多的發(fā)病逡逑機(jī)制以及調(diào)控機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療肝臟疾病提供更多的理論支持。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5


本文編號(hào)：2660737