【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,隨老齡化進(jìn)程的加劇,逐漸影響著中老年人的身心健康,給患者乃至社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)。帕金森病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來,神經(jīng)炎癥機(jī)制引起普遍關(guān)注。原花青素生物學(xué)功能豐富,具有較強(qiáng)的抗炎抗氧化等功能。因而利用原花青素的抗炎和神經(jīng)保護(hù)功能探索防治帕金森病成為研究熱點(diǎn)。本研究首先建立體外帕金森病炎癥損傷模型,以脂多糖(LPS)激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2細(xì)胞),原花青素進(jìn)行干預(yù),以BV2細(xì)胞上清刺激SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞,研究原花青素對BV2細(xì)胞激活介導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并重點(diǎn)研究了原花青素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用機(jī)制,以期為探索防治帕金森病的新策略提供依據(jù)。本研究主要分為兩部分:第一部分:原花青素對小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究目的:LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活,建立帕金森病炎癥損傷模型,觀察原花青素對BV2細(xì)胞激活介導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究方法:1、以不同濃度的LPS(0.01、0.1、1.0、10.0、20.0μg/mL)刺激BV2細(xì)胞,采用Griess法檢測細(xì)胞上清中的一氧化氮(NO)濃度,確定適宜的染毒濃度,構(gòu)建體外炎癥損傷模型。2、采用MTT法檢測實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)LPS及原花青素本身濃度對BV2細(xì)胞活力的影響。設(shè)立調(diào)零組、對照組、LPS(1.0μg/mL)刺激組、不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)干預(yù)組以及LPS(1.0μg/mL)+原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)共同處理組,各組作用24 h后檢測細(xì)胞存活率。3、采用MTT法檢測BV2細(xì)胞上清刺激SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞對細(xì)胞活力的影響同時檢測實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)LPS及原花青素本身對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。LPS(1.0μg/mL)激活BV2細(xì)胞的上清液作為炎癥條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM),原花青素進(jìn)行干預(yù)。設(shè)立對照組、LPS組、不同濃度原花青素處理組,正常培養(yǎng)條件下的BV2上清(C-CM)組、LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活的炎癥條件培養(yǎng)液(LPS-CM)組及LPS-CM+不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)共同處理組,各組作用24 h后檢測細(xì)胞存活率。4、采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-6水平。LPS激活BV2細(xì)胞,原花青素進(jìn)行干預(yù),設(shè)置對照組、LPS(1.0μg/mL)刺激組以及LPS(1.0μg/mL)+不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)處理組。各組作用24 h后檢測細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。5、采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測BV2細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。設(shè)置對照組,BV2細(xì)胞炎癥條件培養(yǎng)液(LPS-CM)干預(yù)組和不同濃度(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)原花青素條件培養(yǎng)液(PC-CM)處理組,作用于SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞,24 h后檢測細(xì)胞凋亡水平。研究結(jié)果:1、不同濃度LPS刺激BV2細(xì)胞,與對照組相比,0.1、1.0、10.0、20.0μg/mL LPS均可增加BV2釋放NO水平(P0.05)。為確保炎癥損傷細(xì)胞模型的建立并減少LPS對細(xì)胞不良影響,以1.0μg/mL LPS染毒BV2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL原花青素單獨(dú)作用或與1.0μg/mL的LPS共同作用以及1.0μg/mL LPS單獨(dú)作用,對BV2細(xì)胞存活率均無影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在實(shí)驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi),LPS及原花青素對BV2細(xì)胞未產(chǎn)生毒性作用。3、MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS(1.0μg/mL)或不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)單獨(dú)作用SH-SY5Y細(xì)胞,對細(xì)胞存活率影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在本實(shí)驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi),LPS及原花青素對SH-SY5Y細(xì)胞未產(chǎn)生毒性作用。靜息BV2細(xì)胞組培養(yǎng)液上清(C-CM)對細(xì)胞存活率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而LPS激活的BV2細(xì)胞炎癥條件培養(yǎng)液(LPS-CM)使SH-SY5Y細(xì)胞活力下降明顯(P0.05)。與C-CM組相比,炎癥條件培養(yǎng)液處理使SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降(P0.05),與LPS-CM組比較,不同濃度原花青素+LPS-CM處理組可提高SH-SY5Y細(xì)胞活力(P0.05)。4、ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS(1.0μg/mL)處理BV2細(xì)胞可提高TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平(P0.05)。與LPS組相比,不同濃度(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)原花青素預(yù)處理可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。5、細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,炎癥介質(zhì)條件培養(yǎng)液處理SH-SY5Y細(xì)胞,明顯促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)處理的條件培養(yǎng)液作用SH-SY5Y細(xì)胞可抑制LPS-CM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,且隨原花青素濃度增大保護(hù)作用明顯增強(qiáng)(P0.05)。研究結(jié)論:LPS激活BV2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞,釋放TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥介質(zhì),介導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。原花青素能有效抑制BV2細(xì)胞活化,降低炎癥介質(zhì)表達(dá),保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。第二部分原花青素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的信號通路研究研究目的:LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活,建立帕金森病炎癥損傷模型,觀察TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信號通路在原花青素抑制脂多糖激活神經(jīng)小膠質(zhì)中的作用。研究方法:1、采用Western Blot法檢測原花青素對LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TLR4、MyD88蛋白表達(dá)以及ERK、p38、JNK蛋白磷酸化的影響。設(shè)置對照組、LPS(1.0μg/mL)染毒組以及LPS(1.0μg/mL)+不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10μg/mL)共同處理組,PC比LPS提前1 h加入,檢測TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38以及p-JNK表達(dá)水平。2、應(yīng)用TLR4、ERK、p38、JNK信號通路阻斷劑,設(shè)立對照組、阻斷劑組、LPS(1.0μg/mL)染毒組、LPS+阻斷劑組以及LPS+PC(10.0μg/mL)處理組,采用Western Blot法檢測TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38以及p-JNK表達(dá)水平。研究結(jié)果:1、Western Blot法檢測原花青素對TLR4受體、MyD88蛋白以及p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS刺激BV2細(xì)胞后蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05)。與1.0μg/mL LPS染毒組相比,不同濃度原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0μg/mL)預(yù)處理BV2細(xì)胞,可下調(diào)蛋白表達(dá)水平且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。2、應(yīng)用信號通路阻斷劑,Western Blot法檢測原花青素對TLR4受體、MyD88蛋白以及p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,阻斷劑單獨(dú)作用于BV2細(xì)胞,對蛋白表達(dá)水平影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而1.0μg/mL LPS染毒組均可誘導(dǎo)蛋白水平顯著升高(P0.05)。與脂多糖組相比,LPS+阻斷劑組均可下調(diào)蛋白表達(dá)水平(P0.05)。原花青素進(jìn)行干預(yù),蛋白表達(dá)水平也顯著下降(P0.05)。證實(shí)原花青素可通過TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信號通路抑制脂多糖激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞。研究結(jié)論:LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信號通路的激活,TLR4、MyD88、p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)水平均明顯增加。原花青素顯著抑制蛋白表達(dá),通過TLR4-MyD88-ERK/p38/JNK MAPK信號通路抑制脂多糖激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞。
【圖文】：

注：與對照組相比，*P<0.05.圖 2-1 不同濃度 LPS 對 BV2 細(xì)胞釋放 NO 的影響青素及 LPS 對 BV2 細(xì)胞活性的影響青素及 LPS 對 BV2 細(xì)胞存活率的影響結(jié)果如圖 2-2 所示。與g/mL LPS 單獨(dú)作用或 0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL 原花青素單濃度原花青素與 1.0 μg/mL 的 LPS 共同作用 BV2 細(xì)胞，對 B響均無明顯差異，且均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果表明范圍內(nèi)，原花青素對小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)或 1.0 μg/mL 的 LP質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞均未產(chǎn)生毒性作用。

注：與對照組相比，，*P<0.05.圖 2-1 不同濃度 LPS 對 BV2 細(xì)胞釋放 NO 的影響原花青素及 LPS 對 BV2 細(xì)胞活性的影響花青素及 LPS 對 BV2 細(xì)胞存活率的影響結(jié)果如圖 2-2 所示。與對.0 μg/mL LPS 單獨(dú)作用或 0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL 原花青素單獨(dú)同濃度原花青素與 1.0 μg/mL 的 LPS 共同作用 BV2 細(xì)胞，對 BV2影響均無明顯差異，且均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果表明在量范圍內(nèi)，原花青素對小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)或 1.0 μg/mL 的 LPS 激膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞均未產(chǎn)生毒性作用。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2659185