【摘要】：研究背景及目的近30年來,我國糖尿病患病率升高了17倍,受到了人們的廣泛關(guān)注。而伴隨糖尿病的諸多并發(fā)癥也對人類健康造成了嚴(yán)重的威脅,其中糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病諸多并發(fā)癥中最嚴(yán)重,也是致死率最高的一種,在I型和II型糖尿病患者中均可發(fā)生,其發(fā)病率分別為15-25%與30-40%。DN也是慢性腎病死亡的主要原因,大概占全世界終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的50%。從西醫(yī)角度來看,DN的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿,特殊的腎臟形態(tài)學(xué)及功能的改變。其主要病理特征是腎小球系膜細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)聚積,腎小球基底膜彌漫性增厚,進(jìn)而造成結(jié)節(jié)性腎小球硬化。其病機(jī)目前尚未完全闡明,但多數(shù)研究表明,DN的發(fā)生和發(fā)展是長期高血糖環(huán)境下多因素綜合作用的結(jié)果,是在主要基因效應(yīng)、平均基因效應(yīng)和多基因或微小基因這三種易感性上,氧化與抗氧化作用失衡,使氧化產(chǎn)物增多,糖脂代謝紊亂、血液變形和流動(dòng)異常、血管舒縮物質(zhì)、具有生物學(xué)效應(yīng)的小分子蛋白物質(zhì)和活性細(xì)胞因子等多種因素共同作用,導(dǎo)致的慢性腎損傷。主要表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)增多,膠原分泌增加,導(dǎo)致腎小球高灌注、高濾過,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球肥大,腎濾過腎功能受損,大量蛋白外漏,以致蛋白尿形成。從中醫(yī)范疇來講,DN既屬消渴病,又屬腎病。如歷代醫(yī)家所述,消渴繼發(fā)水腫、脹滿、尿濁、關(guān)格等病癥皆屬腎病范疇。DN的中醫(yī)病機(jī)是腎虛兼挾血瘀;糖尿病各種合并癥皆為陰虛血瘀;瘀血阻絡(luò)是DN的一個(gè)特點(diǎn),氣虛血瘀、水濕內(nèi)停是其基本病機(jī);又有人在強(qiáng)調(diào)氣陰虛損的同時(shí),更重視瘀結(jié)�？傊�,DN是在糖尿病氣陰兩虛基礎(chǔ)上發(fā)展而來,久病必瘀,久病必虛,久病及腎,脾腎兩虛,水液輸布失常,氣化不利所致�？梢�,DN的落腳點(diǎn)在瘀,中醫(yī)對DN的基本治療原則也是活血化瘀。我們通過查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)以“活血止血之神藥”和“止血而不留瘀”聞名的中藥三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)在中醫(yī)治療腎病方面有著悠久和廣泛的用藥歷史。而我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)三七及其水提物能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和膠原分泌。本文結(jié)合中醫(yī)對DN的認(rèn)識和西醫(yī)對DN病理特征的描述,以抑制腎小球系膜細(xì)胞增生和抑制膠原分泌為指標(biāo),從化瘀類中藥三七中篩選出能顯著抑制腎腎小球系膜細(xì)胞增殖和抑制膠原分泌的成分三七素(dencichine,De),并對其進(jìn)行體內(nèi)外活性評價(jià),對De改善DN中腎損傷的機(jī)制進(jìn)行了探討。研究方法首先,以高糖-DMEM培養(yǎng)基模擬糖尿病體內(nèi)高糖環(huán)境,培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1),造成DN細(xì)胞模型。以抑制HBZY-1增生和抑制膠原分泌為指標(biāo),通過CCK-8、膠原染色的方法從三七的10種含量較高的有效成分中篩選出能顯著抑制HBZY-1增殖和抑制膠原分泌的成分De。并通過MTT、ELISA和免疫熒光等方法對De抑制HBZY-1細(xì)胞增殖和抑制膠原分泌和聚積進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。其次,高脂高糖飼料喂養(yǎng),并結(jié)合45 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),以連續(xù)檢測三次隨機(jī)空腹血糖16.7 mmol/L,同時(shí)尿蛋白陽性視為評判指標(biāo),造成II型DN大鼠模型。同時(shí),分別給予Met、De和三七處理9周,隨時(shí)監(jiān)測一般體征和空腹血糖,于第9周末檢測口服糖耐量后麻醉取血,檢測生化指標(biāo)、胰島素水平、糖化血紅蛋白水平和腎功能等,最后處死大鼠,取腎和胰腺稱重后固定或-80℃冷藏,進(jìn)行病理學(xué)檢測和蛋白分析。再次,采用ELISA、PCR、免疫組化、免疫熒光和Western Blot等方法分別檢測腎組織中I型膠原(Collagen I,Col-I)、IV型膠原(Collagen IV,Col-IV)、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)和層黏連蛋白(laminin,LN)等ECM主要成分及其降解相關(guān)酶MMP-9和TIMP-1的表達(dá),同時(shí)檢測α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、鈣黏附蛋白(E-cadherin,E-Cad)和波形蛋白(vimentin)等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá),從減少ECM和改善EMT兩個(gè)方面評價(jià)三七和De改善腎損傷的作用機(jī)制。最后,采用Western blot和Rt-PCR技術(shù)檢測De對TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白TGF-β1、Smad2/3和Smad7表達(dá)的影響,并探討可能存在的信號調(diào)控通路及其分子作用機(jī)制。研究結(jié)果1三七中主要成分De對HBZY-1細(xì)胞增殖及其對總膠原和ECM聚積和降解的影響三七中主要成分De在1×10~(-3)、1×10~(-4)和1×10~(-5) M可顯著抑制HBZY-1細(xì)胞增殖,且作用優(yōu)于三七中其他8種皂苷類和1中黃酮類成分,也優(yōu)于三七超細(xì)粉溶液。表明De能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞增殖和膠原分泌,其作用也優(yōu)于其他9種成分。進(jìn)一步研究表明,De能降低高糖誘導(dǎo)的Col-I、Col-IV、FN和LN分泌,并能升高M(jìn)MP-9/TIMP-1的比值,而促進(jìn)ECM的降解。2三七和De糾正Ⅱ型DN中糖、脂代謝紊亂和改善腎損傷與模型組相比,De能改善DN大鼠的一般體征。生化檢測結(jié)果表明,De能顯著降低DN大鼠空腹血糖、胰島素水平、糖化血紅蛋白(HbAlc)含量和改善DN大鼠口服糖耐量;降低血清中總膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL),并升高高密度脂蛋白(HDL);降低尿蛋白(Upro),尿素氮(BUN)和尿肌酐(UCr)水平,保護(hù)腎功能、改善腎臟和胰腺的病理性損傷;減少膠原和糖原在腎組織中的沉積,預(yù)防腎纖維化。3三七和De改善腎組織中ECM沉積和改善腎組織EMTDe能顯著減少Col-I、Col-IV、FN和LN等ECM主要成分在腎組織中的表達(dá),并顯著升高M(jìn)MP-9/TIMP-1的比值,以促進(jìn)腎組織中ECM降解;此外,De還能顯著降低α-SMA和Vimentin蛋白,同時(shí)升高E-Cad蛋白的表達(dá)。表明De能通過減少ECM在腎組織中聚積和抑制EMT,從而改善DN中的腎纖維化的發(fā)展。4 De通過抑制TGF-β/Smad信號通路緩解DN中腎損傷De能顯著下調(diào)TGF-β/Smad信號通路中TGF-β1和Smad2/3的表達(dá),并能顯著上調(diào)該信號通路的內(nèi)源性抑制劑Smad7的表達(dá),揭示De可能是通過抑制TGF-β/Smad信號通路緩解DN中腎損傷的分子作用機(jī)制。研究結(jié)論1、證實(shí)了三七和De能顯著改善Ⅱ型DN中腎損傷。三七和De能降低Ⅱ型DN大鼠24 h尿量和尿蛋白排泄、降低尿素氮和尿肌酐水平,減少膠原、糖原和ECM在腎小球的聚積,對DN引起的腎功能障礙和腎病理性損傷有顯著的保護(hù)作用。2、發(fā)現(xiàn)三七和De能有效改善Ⅱ型DN大鼠糖、脂代謝。三七和De能降低Ⅱ型DN大鼠空腹血糖、胰島素水平和糖化血紅蛋白含量,并改善Ⅱ型DN大鼠口服糖耐量受損。3、確證了De是三七中治療Ⅱ型DN的主要物質(zhì)成分。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)三七和De能抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖,ECM聚積和膠原分泌,并能升高M(jìn)MP-9/TIMP-1的比值,以促進(jìn)ECM降解從而抑制腎小球肥大,其作用可與三七原藥材作用相當(dāng);4、初步發(fā)現(xiàn)De能抑制Ⅱ型DN引起的腎纖維化進(jìn)程。三七和De能降低腎組織中膠原的沉積,并降低α-SMA和Vimentin的表達(dá),同時(shí)升高E-Cad蛋白的表達(dá),提示其可能具有抑制Ⅱ型DN引起的腎纖維化作用。
【圖文】：

.1 TGF 超家族及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β 受體（TβR）分為 3 種：TβR I、TβR II 和 TβR III，其中 TβR I、TβR種跨膜糖蛋白是 TGF-β 信號通路所必須的[63]。且只有兩者共同在細(xì)胞膜表面時(shí)，才能將信號放大并傳遞給 TGF-β 反應(yīng)的下游底物[64]。Smads 在 TGF-β 信號通路中起信號介導(dǎo)作用。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了 8 種不同mads 蛋白，即 Smad1～Smad8，可分為 3 個(gè)亞族：受體激活的 Smads（R-Smad用型 Smads （Co-Smad）和抑制型 Smads （I-Smad）。其中 R-Smad 包括 Smad、3、5、8，Co-Smad 受體是 Smad4，I-Smad 包括 Smad6 和 Smad7。R-Smads 磷后能與 Co-Smad Smad4 形成異聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)入進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。I-Smad 可以通競爭性抑制 R-Smad 的活化，促使受體泛素化使之降解，或與 TGF 活化激酶 （ITA）協(xié)同干擾 BMP 誘導(dǎo)的 P38 的激活[65, 66]。TGF-β/Smad 信號通路成員和信號轉(zhuǎn)意圖如圖 1 所示。

移至液氮中保存，并做好記錄和編號。高糖誘導(dǎo) DN 細(xì)胞模型采用含 30 mmol/L葡萄糖的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) HBZY-1 細(xì)胞模擬糖尿環(huán)境，建立 DN 細(xì)胞模型。具體實(shí)驗(yàn)分組及給藥詳見圖 3 和表 1。其中，正培養(yǎng)基為含 5.5 mmol/L 葡萄糖的低糖 DMEM 培養(yǎng)基（LG-DMEM），滲透為 5.5 mmol/L 葡萄糖的 LG-DMEM 配成的 24.5 mmol/L 甘露醇（MA）溶液物臨用前，按 10 倍量稀釋的方法，將母液逐倍稀釋成 1 × 10-3，1 × 10-4，，1 × 10-6備用。實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案按圖 3 所示，對細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組：
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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