發(fā)布時間：2020-05-10 19:02

【摘要】：[目的]從整體、細胞和分子水平,研究中藥復方糖痹康顆粒對糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)PTEN介導的氧化損傷的保護作用,以及糖痹康含藥血清干預高糖誘導雪旺細胞氧化損傷及細胞凋亡的作用機制。[方法]1.整體實驗采用SPF級ICR品系雄性小鼠,給予一次性腹腔內注射STZ誘導造模。正常對照組注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射72h后測量小鼠尾尖血糖值,將兩次隨機血糖不低于300 mg/dL(≥16.7 mmol/L)的小鼠按血糖和體重隨機數(shù)字表法進行分組,分別記為模型組,中藥高、中、低組,及西藥組,每組10只。連續(xù)給藥干預16周。實驗過程中記錄小鼠一般狀況,檢測治療前及治療后4w、8w、12w、16w體重和血糖變化。治療后16w時進行熱痛覺閾值測定,于麻醉狀態(tài)下行坐骨神經(jīng)傳導速度、神經(jīng)血流量測定,取血清檢測ROS、T-AOC水平。取坐骨神經(jīng)組織,4%多聚甲醛固定制作石蠟切片,常規(guī)HE染色、進行病理形態(tài)學觀察;ELISA法測定坐骨神經(jīng)組織勻漿中8-OHdG的表達水平;免疫組化法坐骨神經(jīng)石蠟切片中cleaved-PARP和PTEN的蛋白表達;實時熒光定量PCR法檢測PTEN和caspase3 mRNA表達。2.細胞實驗體外培養(yǎng)大鼠雪旺細胞。SD大鼠灌胃3天制備糖痹康含藥血清及硫辛酸含藥血清。永生型大鼠來源雪旺細胞株RSC96常規(guī)復蘇、培養(yǎng)、傳代至3-5代,采用CCK-8法檢測24h、48h時間點糖痹康含藥血清對細胞活力的影響,采用流式細胞儀檢測FITC-AnnexinV/PI雙標記的細胞凋亡水平,倒置熒光顯微鏡檢測熒光探針DCFH.DA標記的ROS表達,ELISA法檢測細胞上清液中8-OHdG分泌水平,Western blot檢測Nrf2在細胞核/細胞質的表達及轉移率,及PTEN、p-AKT、AKT、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、抗氧化酶NQO1和HO-1蛋白表達;實時熒光定量PCR檢測PTEN、caspase3、NQO1、HO-1 的 mRNA 表達。[結果]1.整體實驗藥物干預16周,模型組小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦,體重降低伴血糖明顯升高(p0.05或p0.01);同時間點比較,中藥高、中、低劑量組和西藥組血糖水平明顯降低(p0.05或p0.01),體重增長明顯升高(p0.05或p0.01)。行為學結果表明,造模16周,模型組小鼠出現(xiàn)嚴重的熱痛覺減退,足底和尾部熱痛閾值顯著增高(p0.01),中藥各劑量組和西藥組小鼠痛閾值減低(p0.05或p0.01),以中藥中劑量組改善作用最為顯著。神經(jīng)電生理檢測及微循環(huán)灌注量檢測結果表明,與正常組比較,模型組小鼠MNCV、SNCV顯著減慢,CMAp、SNAP和Flux減低(p0.05或p0.01),中藥高、中、低劑量及西藥ALA干預均可以明顯提高SNCV、SNAP及Flux(p0.05或p0.01),中藥高劑量組還能有效感受MNCV和CMAP(p0.01)。形態(tài)學觀察結果,模型組小鼠坐骨神經(jīng)纖維排列松散、結構紊亂甚至斷裂,中藥各組和西藥組均可見不同程度的減輕。血清檢測結果表明,與正常組相比,模型組ROS水平明顯升高,T-AOC降低;與模型組比較,中藥各劑量組和西藥組ROS減低,T-AOC增高(p0.05或p0.01),其中中藥高劑量組作用優(yōu)于中、低劑量組。坐骨神經(jīng)組織中8-OHdG含量結果表明,與正常組比較,模型組及各治療組8-OHdG表達均顯著升高(p0.05或p0.01);與模型組比較,中藥高、中劑量組能夠有效降低8-OHdG水平,作用優(yōu)于西藥組(p0.05)。免疫組化法檢測結果顯示,與正常組相比,模型組PTEN和cleaved-PARP的蛋白表達明顯增高(p0.01);與模型組比較,中藥高、中劑量組和西藥組PTEN和cleaved-PARP表達降低(p0.05或p0.01),中藥高劑量組作用優(yōu)于中、低劑量機組和西藥組。PCR檢測結果顯示,與正常組相比,模型組PTEN及caspase3 mRNA表達顯著升高(p0.01),NQO1、HO-1表達無明顯升高(p0.05);與模型組比較,中藥高、中劑量組與西藥組PTEN及 caspase3 mRNA 表達明顯降低(p0.05 或p0.01)。2.細胞實驗細胞活力檢測結果表明,與CON組相比,50mM高糖(HG)組細胞活力顯著降低(p0.01),總凋亡水平均顯著增高(p0.01),ROS及8-OHdG表達顯著增高(p0.01);與HG組相比,TBK組和ALA組細胞活力增高(p0.05或p0.01),凋亡水平降低(p0.05或p0.01),其中TBK組早期凋亡率顯著降低(p0.01),ROS和8-OHdG表達降低(p0.05或p0.01)。Western blot結果顯示,與CON組比,,HG組組PTEN、cleved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表達上調,AKT磷酸化降低(p0.05或p0.01);與HG組比較,TBK組PTEN、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表達水平降低,同時Nrf2核轉移升高,p-AKT、NQO1、HO-1表達增加。PCR結果表明,與CON組相比,HG組PTEN和caspase3mRNA表達增強,NQO1、HO-1mRNA表達無差異(p0.05)。糖痹康和ALA 能夠下調 PTEN、caspase 3mRNA 表達,上調 NQO1、HO-1mRNA 表達(p0.05或p0.01)。[結論](1)中藥復方糖痹康能夠緩解DPN小鼠血糖升高和體重減輕,降低熱痛閾值,提高神經(jīng)傳導速度,改善神經(jīng)微循環(huán)血流量,減輕神經(jīng)纖維結構紊亂。其保護機制可能與調節(jié)神經(jīng)組織氧化應激狀態(tài),減輕DNA損傷和細胞凋亡有關。(2)糖痹康含藥血清能夠減輕高糖抑制的細胞增殖,減少DNA損傷和細胞凋亡。這可能是通過調節(jié)PTEN表達,上調AKT-Nrf2途徑增強細胞抗氧化酶水平,與下調PARP修復損傷實現(xiàn)的。
【圖文】：

圖１－２藥物干預前后各組小鼠血糖結果逡逑３．４熱痛覺閾值測定結果逡逑如表１－３、圖１－３所示，與正常組比較，，模型組ＰＷＴＬ顯著升高（Ｐ＜０．０１），提示逡逑糖尿病小鼠足底溫度覺和痛覺敏感度降低。與模型組比較，縮足反應時間均減少，其中逡逑西藥組和中藥低劑量、中劑量組ＰＷＴＬ明顯降低（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示藥物干預逡逑１６周能夠明顯改善小鼠足底熱痛的敏感性。逡逑光刺激甩尾實驗測定結果顯示，與正常組比較，模型組出現(xiàn)甩尾反應明顯時間延長，逡逑ＴＦＬ升高（Ｐ＜０．０１），提示模型組小鼠發(fā)生尾部組織的痛覺遲鈍。與模型組相比，各治逡逑療組均能有效縮短反應時間，ＴＦＬ數(shù)值減小（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示藥物干預可以逡逑降低ＳＴＺ誘導ＤＰＮ小鼠的熱痛閾值增高，改善熱痛感覺遲鈍。逡逑４９逡逑

３．５神經(jīng)電生理檢測結果逡逑給藥１６周，各組小鼠在麻醉狀態(tài)下進行神經(jīng)電生理檢測。由表１－４－１、表１－４－２和逡逑圖＾４－１、圖１－４－２可見，與正常組相比，模型組出現(xiàn)感覺神經(jīng)及運動神經(jīng)傳導速度降低、逡逑感覺電位和動作電位振幅減�。ǎ校�0．0ｌ或Ｐ＜0．0５），提示ＳＴＺ造模１６周糖尿病小鼠感逡逑５０逡逑
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2657750