發(fā)布時(shí)間：2020-05-10 19:02

【摘要】：[目的]從整體、細(xì)胞和分子水平,研究中藥復(fù)方糖痹康顆粒對(duì)糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)PTEN介導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用,以及糖痹康含藥血清干預(yù)高糖誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞氧化損傷及細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。[方法]1.整體實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)ICR品系雄性小鼠,給予一次性腹腔內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)造模。正常對(duì)照組注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射72h后測(cè)量小鼠尾尖血糖值,將兩次隨機(jī)血糖不低于300 mg/dL(≥16.7 mmol/L)的小鼠按血糖和體重隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組,分別記為模型組,中藥高、中、低組,及西藥組,每組10只。連續(xù)給藥干預(yù)16周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄小鼠一般狀況,檢測(cè)治療前及治療后4w、8w、12w、16w體重和血糖變化。治療后16w時(shí)進(jìn)行熱痛覺(jué)閾值測(cè)定,于麻醉狀態(tài)下行坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)血流量測(cè)定,取血清檢測(cè)ROS、T-AOC水平。取坐骨神經(jīng)組織,4%多聚甲醛固定制作石蠟切片,常規(guī)HE染色、進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察;ELISA法測(cè)定坐骨神經(jīng)組織勻漿中8-OHdG的表達(dá)水平;免疫組化法坐骨神經(jīng)石蠟切片中cleaved-PARP和PTEN的蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PTEN和caspase3 mRNA表達(dá)。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞。SD大鼠灌胃3天制備糖痹康含藥血清及硫辛酸含藥血清。永生型大鼠來(lái)源雪旺細(xì)胞株RSC96常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代至3-5代,采用CCK-8法檢測(cè)24h、48h時(shí)間點(diǎn)糖痹康含藥血清對(duì)細(xì)胞活力的影響,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC-AnnexinV/PI雙標(biāo)記的細(xì)胞凋亡水平,倒置熒光顯微鏡檢測(cè)熒光探針DCFH.DA標(biāo)記的ROS表達(dá),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中8-OHdG分泌水平,Western blot檢測(cè)Nrf2在細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)及轉(zhuǎn)移率,及PTEN、p-AKT、AKT、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、抗氧化酶NQO1和HO-1蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PTEN、caspase3、NQO1、HO-1 的 mRNA 表達(dá)。[結(jié)果]1.整體實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)16周,模型組小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦,體重降低伴血糖明顯升高(p0.05或p0.01);同時(shí)間點(diǎn)比較,中藥高、中、低劑量組和西藥組血糖水平明顯降低(p0.05或p0.01),體重增長(zhǎng)明顯升高(p0.05或p0.01)。行為學(xué)結(jié)果表明,造模16周,模型組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的熱痛覺(jué)減退,足底和尾部熱痛閾值顯著增高(p0.01),中藥各劑量組和西藥組小鼠痛閾值減低(p0.05或p0.01),以中藥中劑量組改善作用最為顯著。神經(jīng)電生理檢測(cè)及微循環(huán)灌注量檢測(cè)結(jié)果表明,與正常組比較,模型組小鼠MNCV、SNCV顯著減慢,CMAp、SNAP和Flux減低(p0.05或p0.01),中藥高、中、低劑量及西藥ALA干預(yù)均可以明顯提高SNCV、SNAP及Flux(p0.05或p0.01),中藥高劑量組還能有效感受MNCV和CMAP(p0.01)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,模型組小鼠坐骨神經(jīng)纖維排列松散、結(jié)構(gòu)紊亂甚至斷裂,中藥各組和西藥組均可見(jiàn)不同程度的減輕。血清檢測(cè)結(jié)果表明,與正常組相比,模型組ROS水平明顯升高,T-AOC降低;與模型組比較,中藥各劑量組和西藥組ROS減低,T-AOC增高(p0.05或p0.01),其中中藥高劑量組作用優(yōu)于中、低劑量組。坐骨神經(jīng)組織中8-OHdG含量結(jié)果表明,與正常組比較,模型組及各治療組8-OHdG表達(dá)均顯著升高(p0.05或p0.01);與模型組比較,中藥高、中劑量組能夠有效降低8-OHdG水平,作用優(yōu)于西藥組(p0.05)。免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組PTEN和cleaved-PARP的蛋白表達(dá)明顯增高(p0.01);與模型組比較,中藥高、中劑量組和西藥組PTEN和cleaved-PARP表達(dá)降低(p0.05或p0.01),中藥高劑量組作用優(yōu)于中、低劑量機(jī)組和西藥組。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組PTEN及caspase3 mRNA表達(dá)顯著升高(p0.01),NQO1、HO-1表達(dá)無(wú)明顯升高(p0.05);與模型組比較,中藥高、中劑量組與西藥組PTEN及 caspase3 mRNA 表達(dá)明顯降低(p0.05 或p0.01)。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明,與CON組相比,50mM高糖(HG)組細(xì)胞活力顯著降低(p0.01),總凋亡水平均顯著增高(p0.01),ROS及8-OHdG表達(dá)顯著增高(p0.01);與HG組相比,TBK組和ALA組細(xì)胞活力增高(p0.05或p0.01),凋亡水平降低(p0.05或p0.01),其中TBK組早期凋亡率顯著降低(p0.01),ROS和8-OHdG表達(dá)降低(p0.05或p0.01)。Western blot結(jié)果顯示,與CON組比,,HG組組PTEN、cleved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表達(dá)上調(diào),AKT磷酸化降低(p0.05或p0.01);與HG組比較,TBK組PTEN、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平降低,同時(shí)Nrf2核轉(zhuǎn)移升高,p-AKT、NQO1、HO-1表達(dá)增加。PCR結(jié)果表明,與CON組相比,HG組PTEN和caspase3mRNA表達(dá)增強(qiáng),NQO1、HO-1mRNA表達(dá)無(wú)差異(p0.05)。糖痹康和ALA 能夠下調(diào) PTEN、caspase 3mRNA 表達(dá),上調(diào) NQO1、HO-1mRNA 表達(dá)(p0.05或p0.01)。[結(jié)論](1)中藥復(fù)方糖痹康能夠緩解DPN小鼠血糖升高和體重減輕,降低熱痛閾值,提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度,改善神經(jīng)微循環(huán)血流量,減輕神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂。其保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)組織氧化應(yīng)激狀態(tài),減輕DNA損傷和細(xì)胞凋亡有關(guān)。(2)糖痹康含藥血清能夠減輕高糖抑制的細(xì)胞增殖,減少DNA損傷和細(xì)胞凋亡。這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN表達(dá),上調(diào)AKT-Nrf2途徑增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶水平,與下調(diào)PARP修復(fù)損傷實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

圖１－２藥物干預(yù)前后各組小鼠血糖結(jié)果逡逑３．４熱痛覺(jué)閾值測(cè)定結(jié)果逡逑如表１－３、圖１－３所示，與正常組比較，，模型組ＰＷＴＬ顯著升高（Ｐ＜０．０１），提示逡逑糖尿病小鼠足底溫度覺(jué)和痛覺(jué)敏感度降低。與模型組比較，縮足反應(yīng)時(shí)間均減少，其中逡逑西藥組和中藥低劑量、中劑量組ＰＷＴＬ明顯降低（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示藥物干預(yù)逡逑１６周能夠明顯改善小鼠足底熱痛的敏感性。逡逑光刺激甩尾實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組出現(xiàn)甩尾反應(yīng)明顯時(shí)間延長(zhǎng)，逡逑ＴＦＬ升高（Ｐ＜０．０１），提示模型組小鼠發(fā)生尾部組織的痛覺(jué)遲鈍。與模型組相比，各治逡逑療組均能有效縮短反應(yīng)時(shí)間，ＴＦＬ數(shù)值減小（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示藥物干預(yù)可以逡逑降低ＳＴＺ誘導(dǎo)ＤＰＮ小鼠的熱痛閾值增高，改善熱痛感覺(jué)遲鈍。逡逑４９逡逑

３．５神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果逡逑給藥１６周，各組小鼠在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行神經(jīng)電生理檢測(cè)。由表１－４－１、表１－４－２和逡逑圖＾４－１、圖１－４－２可見(jiàn)，與正常組相比，模型組出現(xiàn)感覺(jué)神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低、逡逑感覺(jué)電位和動(dòng)作電位振幅減�。ǎ校�0．0ｌ或Ｐ＜0．0５），提示ＳＴＺ造模１６周糖尿病小鼠感逡逑５０逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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10 呂翠巖;張勝容;徐暾海;孫文;賈曉蕾;趙文景;張竹華;劉銅華;;糖痹康對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2016年09期

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本文編號(hào)：2657750