【摘要】：目的:本研究旨在運(yùn)用DNA條形碼、高分辨熔解曲線(xiàn)、HPLC和近紅外光譜四種技術(shù)對(duì)鄂西北地區(qū)柴胡種及質(zhì)量?jī)煞矫孢M(jìn)行分析,為柴胡種快速鑒別和質(zhì)量分析提供研究基礎(chǔ)。方法:(1)采集鄂西北地區(qū)柴胡屬植物北柴胡、狹葉柴胡、竹葉柴胡和三島柴胡等4種植物樣品。提取植物總DNA利用ITS序列和psbA-trn H序列PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)CodonCode Aligner 9.5軟件進(jìn)行拼接,MEGA6.06軟件對(duì)最終序列進(jìn)行分析,基于K2P模型構(gòu)建NJ樹(shù)。(2)將4種12份柴胡屬植物DNA樣品,用ITS2通用引物建立柴胡熔解曲線(xiàn)模型,并對(duì)4種柴胡屬植物進(jìn)行定性鑒別。(3)收集市場(chǎng)銷(xiāo)售柴胡藥材48批HPLC法測(cè)定柴胡皂苷a、d含量,考察柴胡質(zhì)量(4)對(duì)58批柴胡藥材進(jìn)行近紅外光譜采集,以HPLC法測(cè)定柴胡皂苷a、d含量數(shù)據(jù)作為參考,首先使用K-S算法將58批柴胡樣品劃分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集,篩選出光譜最佳預(yù)處理方法,特征譜段以及SVM模型優(yōu)化方法。分別利用PLS算法和SVM算法將訓(xùn)練集柴胡藥材近紅外光譜數(shù)據(jù)分別與柴胡皂苷a、d含量參考值進(jìn)行匹配,建立定量分析回歸模型。結(jié)果和結(jié)論:(1)鄂西北柴胡屬植物ITS序列長(zhǎng)度在534-536bp,種內(nèi)最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離。4種柴胡屬植物NJ樹(shù)各為獨(dú)立一支,均能得到良好區(qū)分。psbA-trnH序列長(zhǎng)度在443bp左右,種內(nèi)最大遺傳距離大于種間最小遺傳距離,無(wú)法用于鑒別4種柴胡屬植物。因此ITS序列作為DNA條形碼,對(duì)鄂西北4種柴胡屬植物具有良好的鑒別能力。(2)4種柴胡屬樣品進(jìn)行HRM實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)4種柴胡屬DNA樣品熔解曲線(xiàn)均為單峰且各種樣品Tm值彼此分開(kāi)。北柴胡熔解曲線(xiàn)Tm為(89.40±0.04)℃;狹葉柴胡熔解曲線(xiàn)Tm為(89.97±0.07)℃;竹葉柴胡熔解曲線(xiàn)Tm為(89.28±0.04)℃;三島柴胡熔解曲線(xiàn)Tm為(89.74±0.08)℃。利用此模型,比較熔解曲線(xiàn)峰型和Tm值即可對(duì)4種柴胡屬植物進(jìn)行鑒別。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,除4、9、30號(hào)樣品外,其他樣品柴胡皂苷a、d總含量均符合《中國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(4)近紅外定量分析柴胡確定了:以FD+MSC為預(yù)處理方法,8750~6000cm-1范圍光譜為最佳譜段,網(wǎng)格尋優(yōu)法為最佳優(yōu)化方法的柴胡皂苷a定量分析模型;無(wú)預(yù)處理光譜,以8750~6000cm-1,4500~4100cm-1為最適譜段,GA法為最佳優(yōu)化方法的柴胡皂苷d定量分析模型。兩個(gè)分析模型RMSECV值分別為1.2471和1.4956,對(duì)柴胡皂苷a、d的定量分析有很好的鑒別精度和預(yù)測(cè)能力,可用于柴胡含量測(cè)定的快速鑒別。
【圖文】：

在電爐上加熱使溶液變澄清，間斷煮沸 2-3 次，取下放置稍冷后入制膠床中，如出現(xiàn)氣泡，可用移液槍槍頭挑破，插入梳子，注意梳子制膠盒底部的距離，太近容易點(diǎn)樣時(shí)不小心戳穿，靜置冷卻，等凝膠凝完全后輕輕拔去梳子，并將凝膠放于裝有 1×TAE 溶液的水平電泳槽中待用。2.1.3 總 DNA 檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)所用的染色劑為 SYBR Green I 的 1%的稀釋液和 6× loadbuffer 以 1:2 的比例配成，取 5μL 提取的樣品總 DNA 與 2μL 染色劑混后加入到 1.0%的瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在裝有 1×TAE 電泳緩沖液的泳槽中以 5V/cm 的電壓電泳 1 小時(shí)，將凝膠置于紫外燈下，觀察到有顯條帶，見(jiàn)圖 1-1。吸取樣品總 DNA1.5μL 上超微量紫外分析儀測(cè)定濃及質(zhì)量，詳見(jiàn)表 1-2.將樣品總 DNA 放置于-20℃冰箱保存。

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2017 屆碩士學(xué)位論文PA/TH 引物的 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性 4min，94℃變性 30s，55 1min，，72℃延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10min，10℃保溫。 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)取擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL 與核酸染料 2μL（Sybra Green I 的 1%稀釋液ding buffer=1:2）混合后加入到 1.0%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，電泳后將凝膠置于紫外燈下觀察，將有明顯條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物置于 4℃冰時(shí)保存，送檢，如圖 1-2 所示。產(chǎn)物條帶模糊或者沒(méi)有條帶的樣品擴(kuò)增，甚至重新提取樣品的 DNA。PCR 產(chǎn)物送交上海生工生物工程股份有限公司測(cè)定，以 5af/4RH 引物為測(cè)序引物，進(jìn)行 DNA 序列的雙向測(cè)定，以保證測(cè)定序列性。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2656584