【摘要】：大黃牡丹湯(Dahuang-mudan decoction,DMD)出自古代醫(yī)學(xué)家張仲景的著作《金匱要略》,該方是由大黃、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁和芒硝經(jīng)過煎煮熬制而成。大黃牡丹湯具有瀉熱祛濕和破淤消癰的功效,自東漢時期起常用于治療濕熱血瘀腸癰證。現(xiàn)代臨床多用于治療炎癥性腸病、急性闌尾炎和急性胰腺炎等炎癥性疾病。其中,炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種可侵犯全消化道并伴有免疫異常的全身性疾病,其發(fā)病特點表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作,難以治愈。近年來,IBD發(fā)病率在全球呈上升趨勢,隨著我國IBD發(fā)病率逐漸上升,使得揭示IBD發(fā)病機制及藥物治療機制愈發(fā)重要。然而,目前還沒有研究可以系統(tǒng)闡釋復(fù)方大黃牡丹湯治療IBD的作用機制。另外,大黃牡丹湯中化學(xué)成分眾多,但并非所有的成分都是有效成分,因此,在化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)不夠明確的情況下,大黃牡丹湯的作用機制研究會受到限制且難以取得實際性的進展。目前,中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究建立了一些有效的方法諸如有效部位研究、拆方研究、指紋圖譜研究、血清藥物化學(xué)研究、中藥藥動學(xué)研究和代謝組學(xué)研究等。本文的目的是在揭示大黃牡丹湯化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的前提下,對其治療IBD的作用機制進行研究,主要從藥動學(xué)和代謝組學(xué)兩方面著手,探討大黃牡丹湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及治療IBD的作用。1.首先,采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q/TOF-MS/MS)對大黃牡丹湯的主要化學(xué)成分進行定性分析,借助高分辨質(zhì)譜儀所提供的化合物的精確相對分子質(zhì)量,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對照,色譜保留時間和一、二級質(zhì)譜等信息,從大黃牡丹湯水煮劑中鑒定和推斷出63個化合物,初步揭示大黃牡丹湯中的主要化學(xué)成分。然后,本課題對大鼠口服大黃牡丹湯后吸收入血的成分進行鑒定,在含藥血漿中鑒定出大黃牡丹湯的27個化合物。2.在此基礎(chǔ)上,本課題選取了 5個在復(fù)方及含藥血漿中濃度相對較高的代表性活性成分,研究這些化合物的藥代動力學(xué)行為。實驗建立了大鼠血漿中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、芍藥苷和苦杏仁苷的定量分析方法并應(yīng)用于大鼠灌胃口服大黃牡丹湯后的藥代動力學(xué)研究。結(jié)果表明,所測定的5個化合物在測定濃度區(qū)間內(nèi)線性關(guān)系良好(r0.997)。方法學(xué)考察結(jié)果表明所建立的定量方法具有足夠的特異性、精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別為84.79%-100.38%和86.3%-112.2%之間,批間精密度均小于12.09%,批內(nèi)精密度均小于6.61%,結(jié)果說明建立的方法簡便可行、準(zhǔn)確可靠且重現(xiàn)性較好,能夠應(yīng)用于5個化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。3.采用TNBS(trinitrobenzene sulfonic acid,三硝基苯磺酸)/乙醇誘導(dǎo)建立IBD大鼠模型及大黃牡丹湯干預(yù)治療效果的研究中,將32只雄性SD大鼠隨機分為正常組(Control group)、IBD 模型組(Model group)、大黃牡丹湯組(DMD group)和美沙拉嗪組(Mesalazine group),每組8只。通過一般行為學(xué)觀察、炎癥細(xì)胞因子檢測、血常規(guī)和結(jié)腸組織病理學(xué)變化等指標(biāo)來評價大黃牡丹湯對TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠的治療效果。結(jié)果表明,IBD大鼠與正常組相比,炎癥狀態(tài)明顯。其中,白細(xì)胞數(shù)(while blood cell,WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(lymphacyte,Lymph)、紅細(xì)胞數(shù)(red blood cell,RBC)及中性粒細(xì)胞數(shù)(granulocyte,Gran)顯著升高(P0.05),血清中的炎癥細(xì)胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量顯著高于正常組(P0.05),而且模型組大鼠結(jié)腸組織病變明顯,符合IBD模型大鼠診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)大黃牡丹湯治療后,以上指標(biāo)均得到不同程度回調(diào),接近正常組大鼠,表明大黃牡丹湯具有緩解TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠炎癥癥狀、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和修復(fù)腸道組織損傷的作用。4.最后,基于超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS/MS),我們采用代謝組學(xué)研究方法從血清及尿液內(nèi)源性代謝小分子層面探究大黃牡丹湯治療TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠作用機制�；趩巫兞考岸嘧兞康臄�(shù)據(jù)統(tǒng)計法,采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析方法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析方法(OPLS-DA)尋找大黃牡丹湯治療IBD大鼠的潛在代謝標(biāo)志物并篩選其靶標(biāo)代謝途徑。結(jié)果,我們在TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠血清中發(fā)現(xiàn)并最終鑒定了與該模型密切相關(guān)的8個生物標(biāo)志物可能與大黃牡丹湯治療IBD大鼠作用機制相關(guān)。經(jīng)相對含量差異分析,與正常組相比,TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠的潛在代謝標(biāo)志物含量異常變化,經(jīng)大黃牡丹湯干預(yù)后,其潛在的代謝標(biāo)志物的含量呈現(xiàn)出不同程度的回調(diào)并接近正常組。在尿液代謝組學(xué)研究中,我們在TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)并最終鑒定了 6個與該模型大鼠尿液代謝關(guān)系密切的生物標(biāo)志物,大黃牡丹湯對這6個尿液代謝生物標(biāo)志物有顯著調(diào)節(jié)的作用。通過MetPA代謝途徑分析,結(jié)果表明這些潛在代謝標(biāo)志物涉及的代謝途徑主要有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;鞘脂代謝;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;色氨酸代謝;苯丙氨酸代謝;嘌呤代謝;膽汁酸生物合成等代謝途徑。本研究基于UPLC-Q/TOF-MS/MS技術(shù),闡明了大黃牡丹湯的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)并揭示了大黃牡丹湯吸收入血的5個主要成分的藥代動力學(xué)特征。研究發(fā)現(xiàn)大黃牡丹湯對TNBS/乙醇誘導(dǎo)的IBD大鼠有良好的治療作用,并從代謝組學(xué)層面揭示其治療IBD的作用機制。
【圖文】：

５６號峰（ｔＲ＝１８．２３邋ｍｉｎ）、５８號峰（ｔＲ＝１９．３４邋ｍｉｎ）、６１邋號峰（ｔＲ＝２２．１５邋ｍｉｎ）、６３號峰（ｔＲ＝２４．９９逡逑ｉｎ）通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜信息比對，結(jié)合文獻(xiàn)報道Ｒｌ，確定這些峰分別為游離蒽逡逑類化合物蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚。其中大黃素的結(jié)構(gòu)解析規(guī)律見圖２－２。逡逑６２號峰（ｔＲ＝２３．５６邋ｍｉｎ）通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜信息比對，結(jié)合文獻(xiàn)報道確定逡逑二蒽醌類化合物大黃素甲醚。逡逑２４號峰（１（＾７．３４１１１丨１１）在負(fù)離子模式Ｆ的加和離子ｗ／ｚ４４５．０８４１，為準(zhǔn)分子離子峰逡逑算分子式為Ｃ＾ＨｍＯｈ。在二級質(zhì)譜中［Ｍ－Ｈ】？發(fā)生裂解依次掉落一分子葡萄糖即為Ｗ／ｚ逡逑８３．０３４８邋［Ｍ－Ｈ－Ｇｌｃ］％該碎片正好是大黃酸的分子離子峰，結(jié)合文獻(xiàn)報道【％，故推測為大黃酸逡逑－０－葡萄糖苷，，其在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖２－３。同理，４６號峰（ｔＲ＝１３．７０邋ｍｉｎ）應(yīng)逡逑大黃酚葡萄糖苷。逡逑５５號峰（ｔＲ＝１７．９８邋ｍｉｎ）在負(fù)離子模式下的加和離子／ｎ／ｚ邋２９７．０４０３邋［Ｍ－Ｈ］＇邋ｉ十算分子式為逡逑ｍＨｍａ、。二級碎片為ｗ／ｚ２５３．０５００和２２５．０６０２，分別對應(yīng)［Ｍ－Ｈ－Ｃ０２］＿和［Ｍ－Ｈ－Ｃ２0３］？，據(jù)文獻(xiàn)１１７１逡逑

廣州中醫(yī)藥大學(xué)２０１９屆碩士學(xué)位論文邐逡逑６０號峰（ｔＲ＝２１．３１ｍｉｎ）在負(fù)離子模式下的加和離子Ｗ／Ｚ３１１．０５５２，為準(zhǔn)分子離子峰［Ｍ－Ｈ］＿，逡逑算分子式為ｃＩ７ｈＩ２ｏ６，分別對應(yīng)［ｍ－ｈ－ｃ２ｈ２ｏ］－和［ｍ－ｈ－ｃ３ｈ３ｏ２］－，結(jié)合文獻(xiàn)［｜７１推測為逡逑，５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－９，１０－ｄｉｏｘｏ－９，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）邋ｍｅｔｈｙｌ邋ａｃｅｔａｔｅ0逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2656568