發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 16:55

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是繼阿爾茨海默癥之后世界上第二大神經(jīng)退行性疾病。PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的死亡和缺失,黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)功能退化,以及神經(jīng)元內(nèi)嗜酸性包涵體Lewy小體的形成。而PD的病因尚不清楚,現(xiàn)有的臨床藥物只能減弱、但不能根治帕金森病的癥狀,且副作用大。近年來(lái),炎癥和自由基假說(shuō)的提出,為研發(fā)新藥開(kāi)辟新的方向。異銀杏雙黃酮是一種天然化合物,在中藥銀杏被首次發(fā)現(xiàn),但含量較低,研究頗少。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn),瑤族民間藥物竹柏中含有較高的異銀杏雙黃酮,且在民間廣泛應(yīng)用于精神疾病的治療。因此,本文主要探究異銀杏雙黃酮在帕金森體內(nèi)體外模型上的作用,并研究其具體的作用機(jī)制,為天然藥物在帕金森病的治療上開(kāi)辟新途徑。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用MPP~+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型:將細(xì)胞接種于96孔板,RA、TPA誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元表型,異銀杏雙黃酮干預(yù)24 h后,加入MPP~+刺激24 h,使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率;熒光分光光度計(jì)檢測(cè)ROS的釋放;qPCR法檢測(cè)凋亡、抗氧化相關(guān)基因mRNA水平的變化;Western Blot檢測(cè)凋亡、抗氧化以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白水平的變化;免疫熒光檢測(cè)原代神經(jīng)元細(xì)胞突起長(zhǎng)度的變化。2.采用MPTP誘導(dǎo)PD動(dòng)物模型:應(yīng)用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森模型的建立;流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞型的表達(dá)以及腹腔巨噬細(xì)胞自噬能力的變化;ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠紋狀體膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況;Western Blot檢測(cè)小鼠紋狀體PI3K/Akt/mTOR以及MAPK通路的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MPP~+刺激誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活率顯著降低,而1μg/mL的異銀杏雙黃酮對(duì)其有顯著改善作用(P0.05);MPP~+刺激的細(xì)胞ROS釋放顯著增強(qiáng),異銀杏雙黃酮能夠有效抑制ROS的釋放(P0.01);qPCR、Western Blot檢測(cè)凋亡Bax、Bcl-2、Caspase3(P0.01),氧化應(yīng)激Nrf2、HO-1、SOD、NQO-1等相關(guān)基因及蛋白(P0.01),都表明MPP~+可以引起細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)(P0.01),而異銀杏雙黃酮可以有效改善細(xì)胞凋亡,并激活機(jī)體抗氧化系統(tǒng)抵抗MPP~+引起的氧化應(yīng)激反應(yīng);在免疫熒光中實(shí)驗(yàn)中也可以看出異銀杏雙黃酮對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞突起的損傷也有改善作用(P0.05)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與MPTP誘導(dǎo)的帕金森模型組來(lái)說(shuō),異銀杏雙黃酮在小鼠爬桿、轉(zhuǎn)棒及曠野的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中均有明顯的改善作用(P0.01);在外周系統(tǒng)中,也可以減緩MPTP導(dǎo)致的腹腔巨噬細(xì)胞自噬功能紊亂以及中樞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)異常(P0.05);異銀杏雙黃酮也會(huì)對(duì)MPTP引起的中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及炎癥因子的釋放有抑制趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.MPP~+可以引起SH-SY5Y細(xì)胞活率的降低,ROS的釋放增加,凋亡相關(guān)的基因與蛋白表達(dá)增高,激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌減少等PD具有的反應(yīng),異銀杏雙黃酮有效地改善這些方面功能的異常,提示異銀杏雙黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化系統(tǒng),增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌,最終調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白的共同作用來(lái)改善MPP~+誘導(dǎo)的PD體外模型。2.異銀杏雙黃酮還可以改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森運(yùn)動(dòng)功能障礙,通過(guò)調(diào)節(jié)中樞膠質(zhì)細(xì)胞的激活和外周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),以及外周和中樞自噬功能來(lái)改善帕金森癥狀。
【圖文】：

酮一貫都有血管清道夫、抗癌勇士、天然免疫增強(qiáng)劑的美稱，而欖抗腫瘤藥物[63]。竹柏還含有豐富的功能成分，具有抗炎、抗氧化、瘤等多種藥理作用。據(jù)表明[64]，在九種黃酮類化合物的篩選中得到穗花杉雙黃酮、銀銀杏雙黃酮等，均顯示出對(duì) β 淀粉樣蛋白引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒損傷表現(xiàn)出強(qiáng)烈的神經(jīng)保護(hù)作用，表明他們治療神經(jīng)退行性疾病aki 等[66]發(fā)現(xiàn) 2,3-二氫穗花衫雙黃酮和 2,3-二氫-6-甲基銀杏黃素能顯E-1[67, 68]。Thapa 等[69]通過(guò)比較單黃酮與雙黃酮對(duì) Aβ 誘導(dǎo)的毒性和作用，發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣杉雙黃酮、2,8-雙芹菜素、穗花衫雙黃酮和蘇曼雙并特異性地抑制 Aβ 的毒性，，減少原纖維的形成[70]。體外試驗(yàn)還顯示化合物可抑制 NF-κB 調(diào)控 TNF- 、IL-1β 的表達(dá)從而影響免疫系統(tǒng)73]研究發(fā)現(xiàn)從日本金銀花中分離得到的金蓮木雙黃酮可下調(diào) IκB ）活性，抑制 NF-κB 活化，發(fā)揮抗炎作用。研究均表明黃酮類天然產(chǎn)物具有治療神經(jīng)退行性疾病的潛力，提示在 PD 疾病中的治療前景與研究潛力。

圖 1-2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線Fig. 1-2. Experimental route銀杏雙黃酮對(duì) MPP+誘導(dǎo)的 SH-SY5Y 細(xì)胞的影響 材料與儀器.1 材料表 2-1 主要的實(shí)驗(yàn)試劑Table 2-1 Main experimental reagents名稱 廠家M 培養(yǎng)基 Gbico 公司 培養(yǎng)基 Gbico 公司%胰酶 Gbico 公司血清 美國(guó) Gbico 公司 Gbico 公司杏雙黃酮 上海源葉生物科技有限公司P+美國(guó) Sigma 公司
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2656447