【摘要】：血栓是血液成分在血管或者心臟內(nèi)膜表面形成的血液凝塊或沉積物,可以發(fā)生在血液中的任何地方導(dǎo)致血液流動停止。在生理情況下,當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞血管壁受到損傷后,血小板隨之附著,導(dǎo)致血小板激活,引起血小板聚集,可發(fā)揮止血作用并且修復(fù)損傷部位。然而,在病理情況下,血小板發(fā)生不正常的或過度的活化可能會在損傷的部位過度聚集進(jìn)行形成血栓成為心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。由此可見,血栓的形成與血小板活化和聚集密切相關(guān)�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),從溫郁金中提取的莪術(shù)二酮具有顯著的抗凝血,抗血栓形成的作用。當(dāng)給予四種誘導(dǎo)劑刺激血小板活化時,發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮對于凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化具有顯著的抑制作用,那么莪術(shù)二酮抑制血小板激活的作用靶點是什么呢?蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量篩選技術(shù),已經(jīng)在尋找藥物對疾病的靶點蛋白,比較蛋白功能水平上被廣泛應(yīng)用,而由于血小板無核,病人血小板功能的異常幾乎完全歸因于蛋白表達(dá)的變化翻譯后修飾的動態(tài)差異,而血小板的蛋白組學(xué)只需要少量毫升的血液就能揭示蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以及蛋白間的相互作用,而非標(biāo)記定量主要是對酶解后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析比較從而對蛋白進(jìn)行相對定量,于是課題組采用了非標(biāo)記定量的蛋白組學(xué)方法進(jìn)行了莪術(shù)二酮對凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活的抑制作用可能機(jī)制的探討。本研究實驗內(nèi)容如下:目的:本研究主要觀察莪術(shù)二酮作用于血小板后蛋白表達(dá)譜的改變情況,探討莪術(shù)二酮抑制血小板活化的可能機(jī)制,并找到具體的作用靶點來解釋作用機(jī)制。方法:首先采用透射電鏡實驗觀察莪術(shù)二酮對凝血酶誘導(dǎo)的人血小板活化的抑制作用,抽取健康志愿者血小板,洗滌后,分為生理鹽水組,凝血酶誘導(dǎo)組以及莪術(shù)二酮孵育組,數(shù)步處理后觀察不同組別的血小板內(nèi)α顆粒的釋放情況。為進(jìn)一步闡明莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的作用機(jī)制,本實驗建立了三組血小板蛋白的液質(zhì)分析總離子流圖譜,將Nano ESI-LC-MS/MS得到的數(shù)據(jù)用Sequest HT引擎搜庫,利用Proteome Discoverer 1.3軟件鑒別各組血小板總蛋白,采用Uni Prot分析軟件分析蛋白。鑒別后的蛋白利用Chrom Align軟件整合,使用SIEVE1.3軟件鑒別不同組之間的差異蛋白。使用IPA和PANTHER等生物信息學(xué)方法搜索差異蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)以及參與的信號通路。利用Western blotting方法驗證蛋白組學(xué)結(jié)果以及添加抑制劑來驗證可能的信號通路與作用靶點。結(jié)果:透射電鏡實驗結(jié)果顯示100μM莪術(shù)二酮能夠明顯抑制0.3 U凝血酶引起的血小板內(nèi)α顆粒的釋放。蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組相比,凝血酶組有22個差異蛋白,其中有8個蛋白上調(diào),14個蛋白下調(diào)。與凝血酶組相比,莪術(shù)二酮組有兩個差異蛋白,Talin1和β1-tubulin在莪術(shù)二酮處理后顯著下調(diào)。生物信息學(xué)結(jié)果提示差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞進(jìn)程,生物粘附以及生物發(fā)展有關(guān),主要參與了整合素信號通路。Western blotting驗證差異蛋白表達(dá)水平與蛋白組學(xué)結(jié)果相同。抑制β1-tubulin的表達(dá)能夠抑制vinculin/talin1的蛋白表達(dá)水平,同時能夠抑制血小板內(nèi)α顆粒的釋放。結(jié)論:莪術(shù)二酮主要是通過調(diào)節(jié)β1-tubulin的表達(dá)調(diào)控vinculin/talin1介導(dǎo)的整合信號通路從而抑制血小板活化;β1-tubulin可能是莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化的具體作用靶點。
【圖文】：

圖 1 莪術(shù)二酮化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 1. Chemical structure of curdione主要是從 DNA 到 mRNA 再到蛋白質(zhì)，存在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，在 mRNA 層面存在水平調(diào)控。然而蛋白質(zhì)層面的調(diào)控不單能全面反應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。有實驗證關(guān)性并不好，特別是對于低豐度蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾以及亞細(xì)胞根據(jù) mRNA 水平來判斷。蛋白質(zhì)是生命相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等蛋白質(zhì)本身蛋白質(zhì)來解決。于是蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而找藥物對疾病的靶點蛋白，比較蛋白功

3 結(jié)果和討論3.1 莪術(shù)二酮對 α-顆粒釋放的抑制作用研究表明，血小板胞內(nèi)主要存在兩種顆粒：α 顆粒和致密顆粒。血小板活化時釋放的 α 顆粒，顆粒中包含 P-選擇素、生長因子、凝血因子和趨化因子等多種分子，參與了血小板聚集過程。為了探究凝血酶作用血小板后 α 顆粒的釋放變化，實驗采用透射電子顯微鏡的方法從血小板形態(tài)學(xué)上進(jìn)行觀察，根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[14]，我們選取了 0.3 U 凝血酶和 100 μM 莪術(shù)二酮作用于血小板，以期得到莪術(shù)二酮抑制血小板活化的能力。在生理鹽水組中，大部分地顆粒內(nèi)容物存在于血小板中，如圖 2 所示，與加入 NS 組相比（如圖 2A），在血小板中加入 0.3 U 凝血酶作用下血小板的 α 顆粒幾乎完全釋放（如圖 2B）。提前孵育 100 μM 莪術(shù)二酮再加入凝血酶誘導(dǎo)后則幾乎完全抑制了凝血酶作用的 α 顆粒的釋放（如圖 2C）。血小板超微結(jié)構(gòu)的觀察提示莪術(shù)二酮能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2654384