【摘要】：目的:本研究以atRA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡制備神經(jīng)管畸形細(xì)胞模型,五子衍宗丸干預(yù)用藥后檢測細(xì)胞活力和凋亡情況,并運(yùn)用RNA-seq技術(shù)對PC12細(xì)胞進(jìn)行全基因組測序分析基因的表達(dá)情況。旨在探討五子衍宗丸對神經(jīng)管畸形細(xì)胞模型凋亡途徑的調(diào)控及其作用機(jī)制。方法:將實(shí)驗(yàn)用PC12細(xì)胞隨機(jī)分為4組:空白組(Control)、模型組(Model)、五子衍宗丸組(WYP),葉酸組(FA),每組3個復(fù)孔。造模前24h給予五子衍宗丸組125μg/mL,葉酸組給予100μg/mL葉酸。XTT法測定PC12細(xì)胞活力,Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡率,高通量RNA-seq測序技術(shù)對細(xì)胞總RNA測序,篩選差異表達(dá)基因,運(yùn)用Venn圖找出感興趣的目的基因集。對目的基因集進(jìn)行GO功能和KEGG通路顯著性富集分析。運(yùn)用WGCNA軟件對五子衍宗丸干預(yù)的atRA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果:1.五子衍宗丸對atRA干預(yù)的PC12細(xì)胞活力的影響五子衍宗丸可增強(qiáng)atRA干預(yù)的PC12細(xì)胞活力,且效果優(yōu)于葉酸。與空白組比,模型組細(xì)胞活力明顯降低(P0.001);與模型組比,五子衍宗丸組細(xì)胞活力明顯升高(P0.001);與模型組比,葉酸組細(xì)胞活力明顯升高(P0.05)。2.五子衍宗丸對atRA干預(yù)的PC12細(xì)胞凋亡的影響五子衍宗丸可降低atRA干預(yù)的PC12細(xì)胞凋亡率,且效果優(yōu)于葉酸。與空白組比,模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.001);與模型組比,五子衍宗丸組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P0.001);與模型組比,葉酸組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P0.01)。3.五子衍宗丸atRA干預(yù)的PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序差異基因表達(dá)分析3.1差異表達(dá)基因和目的基因集的確定及分析五子衍宗丸對atRA引起PC12細(xì)胞的大部分基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)變化都有抑制作用。模型組比空白組有625個基因上調(diào),五子衍宗丸組對其中390個基因有下調(diào)作用,而葉酸組只對其中62個基因有下調(diào)作用;模型組比空白組有1456個基因下調(diào),五子衍宗丸組對其中1073個基因有上調(diào)作用,葉酸組對其中903個基因有上調(diào)作用。3.2目的基因集里凋亡通路中的基因五子衍宗丸相關(guān)的目的基因集有8個我們關(guān)注的rno04210凋亡(Apoptosis)通路中基因,分別是Birc5、Gadd45g、Gadd45b、Nfkbia、Pik3r1、Casp8、Casp12和Ern1。葉酸相關(guān)的目的基因集有3個rno04210凋亡(Apoptosis)通路中基因,分別是Casp12、Ern1、Birc5。3.3目的基因集GO分析五子衍宗丸相關(guān)目的基因集顯著富集到3個我們關(guān)注的凋亡相關(guān)GO條目GO:0043523神經(jīng)元凋亡過程的調(diào)節(jié)(regulation of neuron apoptotic process)、GO:0051402神經(jīng)元凋亡過程(neuron apoptotic process)和GO:0070059內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的內(nèi)在凋亡信號通路(intrinsic apoptotic signaling pathway in response to endoplasmic reticulum stress)。3.4目的基因集KEGG分析五子衍宗丸相關(guān)目的基因集顯著富集rno04110細(xì)胞周期(Cell cycle)、rno03030 DNA復(fù)制(DNA replication)和rno04141內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)等可能與五子衍宗丸作用機(jī)制相關(guān)的KEGG通路。3.5五子衍宗丸對atRA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析除了rno04210凋亡(Apoptosis)通路相關(guān)的基因外,五子衍宗丸抑制凋亡的機(jī)制還可能與Ttk、Sema6b、Mcm5等26個基因相關(guān)。結(jié)論:五子衍宗丸對atRA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有抑制作用,且效果優(yōu)于葉酸。其抑制作用機(jī)制與五子衍宗丸廣泛地抑制模型中基因的過度表達(dá)相關(guān);與下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的Ern1、Casp12基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān);與下調(diào)凋亡相關(guān)基因Caspase家族成員Casp8相關(guān);與上調(diào)凋亡抑制因子基因Birc5、生長停滯和DNA損傷基因Gadd45b、Gadd45g相關(guān);與神經(jīng)元凋亡過程相關(guān);上調(diào)Pik3r1、Nfkbia基因,進(jìn)而可能與PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路相關(guān);可能也與細(xì)胞周期、軸突導(dǎo)向、膽堿能突觸、cAMP信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路及Ttk、Sema6b、Mcm5等26個共表達(dá)分析中連接度較高且與目的基因集里凋亡基因有共表達(dá)相關(guān)性的基因相關(guān)。
【圖文】：

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究五子衍宗丸對 NTDs 細(xì)胞模型凋亡途徑的調(diào)控作用振蕩；掌上離心機(jī)稍離心；夾取 200μLEP 管于管架，將全部的液體轉(zhuǎn)移到 200μLEP 管中，測濃度和純度，標(biāo)號置于-80℃保存。2.6 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理提取的樣本的總 RNA 用 Illumina HiSeqTM2000 進(jìn)行 RNA-seq，，得到每個樣本的測序文件（*R1.fastq.gz，*R2.fastq.gz），用 Fastqc 查看原始序列數(shù)據(jù)質(zhì)量，根據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量情況用 cutadapt 剪掉前 10bp 非正常數(shù)據(jù)，然后用 Trim_galore 清洗數(shù)據(jù)去掉低質(zhì)量堿基及 adaptor 序列，再用 Fastqc 查看數(shù)據(jù)質(zhì)量，沒問題進(jìn)行下一步。使用 STAR_2.6.4b 生成以大鼠基因組（UCSC rn6）為 GTF 注釋文件的genome 索引文件，然后將處理后的 reads 進(jìn)行與生成的 genome 比對生成*.BAM文件，使用 featureCounts 對 RNA-seq read（spaired-end）計算 counts 值，生成 counts文件。圖 1 所示為轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理流程圖。

基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究五子衍宗丸3.3 五子衍宗丸 atRA 干預(yù)的 PC123.3.1 差異表達(dá)基因的確定為了對各樣本聚類及基因的差異表edgeR 包作 MDS（Multidimentional sca型組（Model）、五子衍宗丸組（WYP）較為集中，說明各組的重復(fù)聚類性較好五子衍宗丸組和葉酸組的樣本位置較為著。
【學(xué)位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2649050