【摘要】：背景肺癌是世界范圍內最常見的惡性疾病之一,嚴重威脅人類的健康,發(fā)現新型有效的安全藥物是目前肺癌治療的急迫需要和研究動力。蟾酥,是從蟾蜍的皮膚和腮腺中提取的乙醇萃取物,在我國傳統(tǒng)的抗癌治療中應用廣泛。華蟾酥毒基(Cinobufagin,CnBu),是最新發(fā)現的從中華大蟾蜍的皮膚上提取的生物活性成分,被報道證實具有多種藥理作用,是蟾酥的活性成分之一,對多種人類腫瘤細胞株有廣譜細胞毒性,具有新型抗腫瘤活性。但是CnBu在人肺癌細胞的體內效應和作用機制尚未明確,相關的可行性實驗非常少。目的在本實驗中,我們通過體內和體外實驗初步探討CnBu在肺癌細胞中的抗癌活性及機制,旨在為CnBu的進一步臨床應用提供實驗依據以及參考。方法(1)使用CnBu、沙蟾毒精和蟾毒靈對人肺癌細胞系和對照細胞進行處理后,使用MTT法檢測細胞活力。加入CnBu孵育24-48小時后,通過人工計數確定細胞遷移數。我們采用Transwell Boyden小室評估CnBu對A549細胞侵襲的影響。加入CnBu孵育24小時后,使用姬姆薩染色,通過人工計數定量侵襲細胞數。(2)我們應用TUNELDAPI聯合染色試驗試劑盒檢測CnBu誘導的細胞凋亡。經測試藥物處理后,使用特殊的Caspase底物及熒光法檢測細胞內的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性。熒光顯微鏡及線粒體特異性探針(MitoTracker Red CMXRos)分析CnBu處理后A549細胞中線粒體形態(tài)的改變。DHE熒光探針分析ROS在各組細胞內的含量,并對比加與不加ROS的清除劑NAC預處理的各組細胞的活力變化。(3)我們將A549細胞注射到雄性裸鼠右后脅,10天后,對裸鼠注射CnBu 28天。實驗結束時將移植瘤切除并稱重、測量尺寸;每個組織分別切片脫蠟HE染色,形態(tài)學檢測及組織學觀察,TUNELDAPI共染色試驗檢測各組腫瘤細胞切片凋亡情況;免疫熒光染色分析磷酸化p53免疫熒光成像。采用QW550圖像分析軟件半定量分析Ki67蛋白和磷酸化p53的表達。結果(1)結果提示,CnBu在肺癌細胞中較蟾毒靈和沙蟾毒精表現出更高的抗癌效果,IC50值范圍為2.3-6.7μM。同時,CnBu比對照細胞表現出更低的毒性,IC50值為22.3μM,提示CnBu對腫瘤細胞和正常細胞有較高的選擇性。CnBu同時表現出與劑量相關的阻礙A549細胞遷徙、入侵的特性。(2)此外,CnBu的處理提高肺癌細胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性,有效地誘導A549細胞凋亡�？拱┲委燂@著激活線粒體的裂解和ROS過度產生。有趣的是,抗氧化劑的添加明顯減少CnBu誘導的細胞死亡,這一結果顯示ROS在CnBu誘導的細胞凋亡過程中的重要作用。(3)最后,在體內實驗中,我們的結果顯示CnBu的處理誘導移植瘤細胞凋亡,上調了細胞增殖的生物標志物Ki-67蛋白及磷酸化的重要抗癌因子p53蛋白的表達。這些體內實驗結果進一步驗證了 CnBu的抗癌功能。結論我們的研究結果顯示CnBu可能通過誘導細胞凋亡及提高磷酸化的p53蛋白的表達起到抑癌作用。
【圖文】：

癌細胞邐正常細胞逡逑圖１－２華蟾酥毒基、蟾毒靈、蟾酥的體外抗癌活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＣｎＢｕ），邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋（Ｂｕ）邋ａｎｄ逡逑Ａｒｅｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＡｒＢｕ）．逡逑２抑制肺癌細胞遷移和侵襲檢測結果逡逑鑒于Ａ５４９細胞系對華蟾酥毒基的處理最為敏感，我們后續(xù)的研宄選取這逡逑一細胞系對華蟾酥毒基的作用特性及機理作進一步的研宄。首先，鑒于肺癌細逡逑胞具有轉移性，，我們檢測了華蟾酥毒基對肺腺癌Ａ５４９細胞轉移潛能的抑制作逡逑用。我們通過細胞遷移實驗（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙ）分析華蟾醉毒基對Ａ５４９逡逑細胞是否具有抗轉移能力。我們首先確定在高細胞密度下（ｌｘｌＯ６／每孔），０．５｜ｉＭ逡逑２１逡逑

ｉｃ邐￣ｃ逡逑圖１－１在反相高效液相色譜儀（安捷倫１１００系列）上所檢測的華蟾酥毒基的吸收峰逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ邋ＨＰＬＣ邋ｔｒａｃｅｓ邋ｆｏｒ邋ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋ｏｎ邋Ａｇｉｌｅｎｔ邋１１００邋ｓｅｒｉｅｓ邋ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ．逡逑４０邋＿邋＾ＨＣｎＢｕ邐Ｔ逡逑WＢｕ逡逑ＨＡｒＢｕ逡逑ｒ邐Ｊ逡逑Ａ５４９邋ＮＣＩ－Ｈ４６０邋Ｈ１２９９邋Ｓｋ－ｍｅｓ－１邋Ｃａｌｕ－３邋ＢＥＡＳ－２Ｂ逡逑癌細胞邐正常細胞逡逑圖１－２華蟾酥毒基、蟾毒靈、蟾酥的體外抗癌活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＣｎＢｕ），邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋（Ｂｕ）邋ａｎｄ逡逑Ａｒｅｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＡｒＢｕ）．逡逑２抑制肺癌細胞遷移和侵襲檢測結果逡逑鑒于Ａ５４９細胞系對華蟾酥毒基的處理最為敏感，我們后續(xù)的研宄選取這逡逑一細胞系對華蟾酥毒基的作用特性及機理作進一步的研宄。首先，鑒于肺癌細逡逑胞具有轉移性，我們檢測了華蟾酥毒基對肺腺癌Ａ５４９細胞轉移潛能的抑制作逡逑用。我們通過細胞遷移實驗（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙ）分析華蟾醉毒基對Ａ５４９逡逑細胞是否具有抗轉移能力。我們首先確定在高細胞密度下（ｌｘｌＯ６／每孔），０．５｜ｉＭ逡逑２１逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2646007