【摘要】：目的:探究石菖蒲多糖對(duì)抑制激活核因子kappa B受體(RANK)的配體(RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的分子機(jī)制及其對(duì)LPS刺激的小鼠急性骨丟失癥狀的抑制效果。方法:(1)取骨髓來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞,利用M-CSF誘導(dǎo)其分化成為骨髓巨噬細(xì)胞。(2)利用噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)不同濃度的石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性的影響。(3)利用不同濃度的石菖蒲多糖作用于兩種刺激因子(M-CSF、RANKL)作用下的骨髓巨噬細(xì)胞,通過(guò)TRAP染色法檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響,初步確定石菖蒲多糖的有效藥物濃度。(4)將不同濃度的石菖蒲多糖作用于種植在骨仿生培養(yǎng)板上的RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞,利用VonKossa染色法檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)骨吸收功能的影響,并利用熒光染色法檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白(F-actin)的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收活性的影響,篩選出石菖蒲多糖影響破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的有效藥物濃度。(5)將石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞,收取第1天到第4天的RNA樣品,利用熒光定量PCR檢測(cè)TRAP、OSCAR、整合素αvβ3、ATP6V0d2、MMP9和CtsK的mRNA含量,評(píng)價(jià)石菖蒲多糖對(duì)于破骨細(xì)胞生成及功能相關(guān)基因的影響。(6)將石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞,分別收取1、2、3、4天的RNA樣品與蛋白樣品,分別通過(guò)熒光定量PCR與WB兩種方式檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFATc1與c-Fos在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)的影響。(7)將石菖蒲多糖放入RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞中培養(yǎng),利用WB檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)MAPK中JNK,ERK,p38蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)情況,評(píng)價(jià)石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞模型中MAPK信號(hào)通路的影響。(8)將石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞,利用WB檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)NF-κB家族IκB-α/GAPDH,p-p65/p65蛋白表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞模型中NF-κB信號(hào)通路的影響。(9)將石菖蒲多糖作用于RANKL刺激下的骨髓巨噬細(xì)胞,利用WB檢測(cè)石菖蒲多糖對(duì)影響NFATc1翻譯后修飾的信號(hào)通路,即Ca~(2+)信號(hào)通路中p-PLCγ2/PLCγ2,PP2B-Aα/GAPDH表達(dá)的調(diào)控作用,并利用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)變化情況,評(píng)價(jià)石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞模型中PLCγ2/Ca~(2+)信號(hào)通路的影響。(10)將LPS誘導(dǎo)的骨丟失模型鼠進(jìn)行石菖蒲多糖灌胃處理,設(shè)置鹽水組、LPS組、高濃度加藥組與低濃度加藥組,分別利用石蠟組織切片與Micro-CT掃描觀察并測(cè)量骨組織變化,評(píng)價(jià)石菖蒲多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠骨丟失模型的影響。結(jié)果:(1)15.625μg/m L-250μg/m L濃度區(qū)間的石菖蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。(2)石菖蒲多糖呈濃度依賴性抑制破骨細(xì)胞生成,125μg/m L與250μg/m L效果較好,能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)石菖蒲多糖31.25μg/mL-250μg/mL呈濃度依賴性抑制破骨細(xì)胞骨吸收活性。(4)石菖蒲多糖62.5μg/m L-250μg/m L均能抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的生成,且125μg/mL與250μg/m L效果較好,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度使用125μg/mL。(5)石菖蒲多糖在1-4天均可以抑制TRAP、OSCAR、整合素αvβ3、ATP6V0d2、MMP9和CtsK的基因表達(dá),說(shuō)明石菖蒲多糖可以抑制由RANKL引起的破骨細(xì)胞生成及功能相關(guān)基因的表達(dá)。(6)無(wú)論是在蛋白水平還是在轉(zhuǎn)錄水平,石菖蒲多糖對(duì)于由RANKL引起的NFATc1與c-Fos的表達(dá)增加都有抑制作用,說(shuō)明石菖蒲多糖可以抑制破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。(7)石菖蒲多糖對(duì)與由RANKL引起的ERK1/2、JNK、p38的磷酸化效果沒(méi)有抑制作用,說(shuō)明石菖蒲多糖不是通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。(8)石菖蒲多糖對(duì)由RANKL引起的IκB-α的降解及p65的磷酸化沒(méi)有抑制效果,說(shuō)明石菖蒲多糖不是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞生成。(9)石菖蒲多糖可以抑制由RANKL引起的PLCγ2及PP2B-Aα的活化,并且減緩由RANKL引起的Ca~(2+)震蕩,說(shuō)明石菖蒲多糖是通過(guò)抑制PLCγ2/Ca~(2+)信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成。(10)石菖蒲多糖可以減弱由LPS引起的小鼠腿骨骨小梁密度降低以及其離散度增加,但對(duì)于骨體積沒(méi)有影響,說(shuō)明石菖蒲多糖是通過(guò)調(diào)節(jié)骨小梁的密度及離散度來(lái)保護(hù)由LPS引起的骨丟失癥狀,并不是通過(guò)調(diào)節(jié)骨量。結(jié)論:石菖蒲多糖通過(guò)PLCγ2/Ca~(2+)/PP2B-Aα信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞形成及骨吸收活性;石菖蒲多糖能夠保護(hù)由LPS刺激的骨丟失癥狀。
【圖文】：

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果蒲多糖對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞活性的影響度為 15.625 μg/mL-250 μg/mL 的石菖蒲多糖作用于 M-CSF 刺激的8 h，觀察其對(duì)細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示 15.625 μg/mL-250 μg/m與 M-CSF 單獨(dú)刺激的細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異（如圖 3.1），所以石5.625 μg/mL-250 μg/mL 濃度下對(duì)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的存活率均用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 3.2 ACP 對(duì) RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的影響（TRAP 染色，放大 100 倍）（A）ACP 對(duì) RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的影響。（B）每孔中 TRAP 陽(yáng)性比*p < 0.05，，** p < 0.01，*** p < 0.001 與造模組（RANKL+）相比。3.3 石菖蒲多糖抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收作用3.3.1 石菖蒲多糖抑制骨吸收活性人體內(nèi)，只有破骨細(xì)胞能夠執(zhí)行骨吸收功能，起到降解骨基質(zhì)的效果，所以通過(guò)檢測(cè)骨吸收活性來(lái)進(jìn)一步證明藥物對(duì)破骨細(xì)胞功能的影響，Von Kossa 染法檢測(cè)結(jié)果（如圖 3.3）。圖中白色空斑部分為形成骨凹陷的部分，在 31
【學(xué)位授予單位】：北華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2645652