【摘要】：鐵皮石斛(蘭科草本植物Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖),主要分布于浙江、廣州和云南等地,是一種傳統(tǒng)名貴中藥材,具有生津益胃、滋陰清熱以及潤(rùn)肺益腎等功效,在民間,被譽(yù)為“救命仙草”和藥界的“大熊貓”。鐵皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)是鐵皮石斛的主要生物活性成分之一,具有顯著的藥理活性,包括抗氧化、抗病毒、抗炎、抗衰老、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等活性。本課題組近年來(lái)致力于鐵皮石斛多糖的提取分離純化方法及相關(guān)生物活性的研究。前期研究發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛多糖可有效緩解2型糖尿病(T2DM)小鼠的糖代謝紊亂,其降糖作用機(jī)制可能與胰島素介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。然而,目前已有文獻(xiàn)從分子水平探討鐵皮石斛多糖降糖作用機(jī)制的研究主要集中于胰島素途徑,機(jī)制單一,研究并不充分。因此,進(jìn)一步探討其降糖作用機(jī)制變得尤其重要。本課題擬沿用課題組前期已確立的成熟提取工藝,從浙江樂(lè)清鐵皮石斛干燥莖中提取分離純化鐵皮石斛多糖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以高脂高糖飼料(HFD)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)建立的T2DM模型為研究對(duì)象;體外實(shí)驗(yàn)以高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型為研究對(duì)象;旨在全面系統(tǒng)地研究鐵皮石斛多糖對(duì)2型糖尿病小鼠高血糖癥的緩解作用及其作用機(jī)制,完善其分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò),為鐵皮石斛多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。第一部分鐵皮石斛多糖的提取分離、純化及鑒定采用水提醇沉法從浙江樂(lè)清鐵皮石斛干燥莖中得到鐵皮石斛多糖水提液;水提液經(jīng)醇沉、干燥得到鐵皮石斛粗多糖;再將鐵皮石斛粗多糖經(jīng)反復(fù)凍融后,超濾、凍干,最終得到水溶性棉花絮狀精制鐵皮石斛多糖DOP。苯酚-硫酸法、HPGPC法及紫外掃描法結(jié)果顯示,鐵皮石斛多糖的糖含量為99.36%、重均分子量為190 kDa、幾乎不含蛋白質(zhì)和核酸。同時(shí)HPLC法測(cè)定鐵皮石斛多糖的單糖組成為甘露糖:葡萄糖=4.41:1.00。該部分實(shí)驗(yàn)提取純化的鐵皮石斛多糖性狀產(chǎn)率穩(wěn)定、分子量均一、純度高,滿足后續(xù)藥理學(xué)研究的要求。第二部分鐵皮石斛多糖緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥的作用研究高脂高糖飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠8周并聯(lián)合小劑量多次腹腔注射STZ成功誘導(dǎo)建立T2DM模型(以空腹血糖水平FBG≥11.1mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)),之后給予低、中、高劑量的鐵皮石斛多糖治療4周。給藥期間定期觀察各組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài),并記錄各組小鼠的空腹血糖FBG和體重;處死各組小鼠前進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT);解剖后檢測(cè)各組小鼠血清胰高血糖素水平;制作肝臟組織和胰腺組織HE染色切片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予鐵皮石斛多糖4周后,低、中、高劑量給藥組小鼠活動(dòng)狀態(tài)好轉(zhuǎn),體重有所升高,高血糖癥也得到明顯改善。同時(shí),預(yù)防給藥組小鼠血糖水平也較模型對(duì)照組顯著性降低,表明鐵皮石斛多糖對(duì)2型糖尿病小鼠高血糖癥的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵皮石斛多糖能夠顯著提高2型糖尿病小鼠對(duì)葡萄糖的耐受力,修復(fù)受損的糖耐量。而且,鐵皮石斛多糖給藥組小鼠血清胰高血糖素水平較模型對(duì)照組小鼠顯著性下降,表明鐵皮石斛多糖能夠抑制2型糖尿病小鼠胰高血糖素的分泌,緩解2型糖尿病小鼠的高血糖癥。此外,HE染色切片顯示鐵皮石斛多糖能夠顯著改善2型糖尿病小鼠肝臟的脂肪變性及胰腺損傷現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)鐵皮石斛多糖可以降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖水平、提高葡萄糖耐受力、降低血清胰高血糖素水平以及改善肝臟脂肪變性和胰腺損傷,緩解2型糖尿病小鼠的高血糖癥。第三部分鐵皮石斛多糖緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥的機(jī)制研究給予鐵皮石斛多糖結(jié)束后,解剖小鼠,分離肝臟,制作肝臟PAS染色切片,觀察肝糖原的分布情況;同時(shí)采用生化法檢測(cè)小鼠肝糖原含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鐵皮石斛多糖能夠顯著提高2型糖尿病小鼠的肝糖原含量。與此同時(shí),從肝糖原代謝和肝糖異生兩大方面探討鐵皮石斛多糖緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥的分子機(jī)制。采用Western blot法檢測(cè)小鼠肝糖原代謝相關(guān)酶GS、p-GS、PYGL和GBE及cAMP-PKA信號(hào)通路相關(guān)蛋白Glucagon、GCGR、AC、PKA-C和p-PKA的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示鐵皮石斛多糖可通過(guò)下調(diào)2型糖尿病小鼠肝臟cAMP-PKA信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量,調(diào)節(jié)肝糖原代謝相關(guān)酶的表達(dá),表明鐵皮石斛多糖能夠抑制2型糖尿病小鼠cAMP-PKA信號(hào)通路,調(diào)節(jié)肝糖原代謝,從而發(fā)揮緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥的作用。此外,采用Western blot法檢測(cè)小鼠肝糖異生相關(guān)酶PEPCK和G6Pase及Akt/FoxO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示鐵皮石斛多糖能夠上調(diào)2型糖尿病小鼠肝臟p-Akt及p-FoxO1蛋白的表達(dá)量,下調(diào)肝糖異生酶PEPCK和G6Pase的表達(dá),表明鐵皮石斛多糖能夠刺激2型糖尿病小鼠Akt/FoxO1信號(hào)通路,抑制肝糖異生,從而緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥。本部分實(shí)驗(yàn)證明鐵皮石斛多糖能夠影響2型糖尿病小鼠肝臟由胰高血糖素介導(dǎo)的cAMP-PKA和Akt/FoxO1兩條信號(hào)通路,促進(jìn)肝糖原合成,抑制肝糖原分解以及肝糖異生,從而改善肝糖代謝,緩解2型糖尿病小鼠的高血糖癥。第四部分體外探討鐵皮石斛多糖通過(guò)抑制cAMP-PKA信號(hào)通路對(duì)肝糖原代謝的調(diào)控作用為了驗(yàn)證鐵皮石斛多糖能夠通過(guò)抑制cAMP-PKA信號(hào)通路調(diào)控肝糖原代謝從而緩解2型糖尿病小鼠高血糖癥這一機(jī)制,本部分實(shí)驗(yàn)建立了高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型,并用鐵皮石斛多糖干預(yù)培養(yǎng)24 h。采用Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中肝糖原代謝相關(guān)酶GS、p-GS、PYGL和GBE及cAMP-PKA信號(hào)通路相關(guān)蛋白Glucagon、GCGR、AC、PKA-C和p-PKA的蛋白表達(dá)水平,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。表明,鐵皮石斛多糖能夠抑制高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞cAMP-PKA信號(hào)通路,調(diào)節(jié)肝糖原代謝。為進(jìn)一步確定鐵皮石斛多糖對(duì)cAMP-PKA信號(hào)通路的抑制作用,我們?cè)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)中加入了腺苷酸環(huán)化酶(AC)激活劑。結(jié)果顯示鐵皮石斛多糖干預(yù)培養(yǎng)24 h后,HepG2細(xì)胞中cAMP-PKA信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量均顯著下調(diào),而AC激活劑可補(bǔ)償鐵皮石斛多糖的這一作用,再次證實(shí)鐵皮石斛多糖能夠抑制cAMP-PKA信號(hào)通路。第五部分鐵皮石斛多糖對(duì)2型糖尿病小鼠肝糖原分子結(jié)構(gòu)的影響采用溫和的肝糖原提取方法從各組小鼠的肝臟組織中提取出肝糖原,再將其純化、凍干,最終得到白色水溶性棉花絮狀肝糖原。采用分子體積排阻色譜(SEC)對(duì)肝糖原分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示正常組小鼠的肝糖原分子結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性,DMSO處理前后無(wú)明顯變化;而2型糖尿病小鼠的肝糖原分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差,α粒子較脆弱,在DMSO中易降解為β粒子。在給予鐵皮石斛多糖4周后,給藥組小鼠的肝糖原分子結(jié)構(gòu)較模型組小鼠穩(wěn)定,DMSO處理前后無(wú)明顯變化,表明鐵皮石斛多糖能夠改善2型糖尿病小鼠肝糖原分子結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,顯著抵抗DMSO對(duì)α粒子的降解作用,使其不易降解,從而發(fā)揮降糖作用,改善2型糖尿病小鼠的高血糖癥。
【圖文】：

最終得到的鐵皮石斛粗多糖呈灰白色粉末狀（圖1-1 B）。圖 1-1（A）鐵皮石斛干燥莖；（B）鐵皮石斛粗多糖。Figure 1-1 (A) The dry stems of Dendrobium officinale; (B) The crude Dendrobium officinalepolysaccharide.

經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的超濾及凍干后最終得到精制的鐵皮石斛多糖，，呈淡黃色棉花絮狀（圖1-2 B）。圖 1-2（A）凍融后的鐵皮石斛多糖溶液；（B）精制的鐵皮石斛多糖。Figure 1-2 (A) Dendrobium officinale polysaccharide solution after freeze-dissolution; (B)Refined Dendrobium officinale polysaccharide.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2645120