【摘要】：研究背景功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是臨床中最為常見(jiàn)的功能性胃腸病之一,其典型臨床癥狀包括上腹痛、飽脹感、早飽、惡心等,影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)羅馬IV標(biāo)準(zhǔn),FD分為兩個(gè)亞型:餐后不適綜合征(Postprandial discomfort syndrome,PDS)和上腹痛綜合征(Epigastric pain syndromeEPS),PDS的臨床癥狀主要為飽腹感和早飽感,EPS主要表現(xiàn)為上腹痛或灼痛,在臨床中,二者可單獨(dú)出現(xiàn),也可重疊發(fā)生。內(nèi)臟高敏感是FD重要的發(fā)病機(jī)制之一。內(nèi)臟高敏感形成的機(jī)制復(fù)雜,最終結(jié)果通常導(dǎo)致內(nèi)臟傳入神經(jīng)元和脊髓背角神經(jīng)元的敏化,或脊髓傷害感受神經(jīng)元的下行興奮和抑制作用發(fā)生障礙,導(dǎo)致生理性刺激感受閾值降低和對(duì)傷害性感覺(jué)刺激反應(yīng)強(qiáng)烈。這些機(jī)制有可能獨(dú)立存在或相互作用,最終促進(jìn)了內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。內(nèi)臟高敏感的誘發(fā)因素有多種,包括機(jī)械刺激、近端十二指腸化學(xué)刺激、低溫、心理精神因素等。機(jī)械刺激誘導(dǎo)一直是FD內(nèi)臟高敏的研究熱點(diǎn)。胃腸道內(nèi)存在多種機(jī)械敏感細(xì)胞,如腸嗜鉻細(xì)胞(Enterochromaffin cells,EC)、內(nèi)在和外在腸神經(jīng)元細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和Cajal間質(zhì)細(xì)胞等,可感知并傳遞機(jī)械刺激信號(hào)。近年來(lái),腸嗜鉻細(xì)胞表面存在的多種機(jī)械敏感性離子通道被一一研究和揭示,EC細(xì)胞作為胃腸道重要的機(jī)械感知細(xì)胞,對(duì)胃腸道正常生理功能的行使具有重要作用。與此同時(shí),EC細(xì)胞是血清素釋放的主要來(lái)源之一,而機(jī)械刺激導(dǎo)致的血清素異常釋放可誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏的發(fā)生。有關(guān)EC細(xì)胞機(jī)械敏感性離子通道或受體與血清素釋放的關(guān)系尚未完全明了,以此為切入點(diǎn)研究FD內(nèi)臟高敏的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。目前,FD的治療主要以對(duì)癥治療為主,促動(dòng)力藥、抑酸藥和抗抑郁藥被廣泛應(yīng)用,但是效果單一,且易反復(fù)發(fā)作。中醫(yī)藥在整體調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上顯示了其在治療FD方面的優(yōu)勢(shì)。脾虛證是FD最常見(jiàn)的基礎(chǔ)證型,香砂六君子湯作為治療FD脾虛證的經(jīng)典代表方藥,具有健脾和胃,理氣消脹的作用,不僅僅可提高胃腸動(dòng)力,在治療胃痛胃脹,改善內(nèi)臟高敏感現(xiàn)象中也具有良好功效。香砂六君子湯在降低內(nèi)臟高敏中的機(jī)制尚不明確,本研究將從EC細(xì)胞機(jī)械敏感性離子通道的角度入手,研究香砂六君子湯對(duì)其影響,探討香砂六君子湯在內(nèi)臟高敏感發(fā)生機(jī)制中的作用。第一部分PIEZO2離子通道在FD患者胃底黏膜組織中表達(dá)情況的研究研究目的明確PIEZO2在胃底黏膜層EC細(xì)胞中的表達(dá)情況。研究方法收集FD患者和正常人胃底黏膜組織,進(jìn)行免疫熒光染色和WB檢測(cè),觀(guān)察EC細(xì)胞和PIEZO2蛋白在FD患者和正常人胃底組織黏膜層中的表達(dá)情況。研究結(jié)果EC細(xì)胞和PIEZO2皆主要存在于黏膜層中。與正常人相比,FD患者胃底黏膜層EC細(xì)胞和PIEZO2表達(dá)量均增多。研究結(jié)論1人胃底組織黏膜層中存在PIEZO2的表達(dá)。2較之正常人,FD內(nèi)臟高敏患者胃底黏膜層的PIEZO2、EC細(xì)胞和5-HT表達(dá)量較高。第二部分QGP-1細(xì)胞機(jī)械力刺激模型的建立及抑制劑干預(yù)對(duì)QGP-1釋放5-HT的影響研究目的采用EC細(xì)胞模型QGP-1細(xì)胞,分析在機(jī)械力刺激中,EC細(xì)胞釋放5-HT與PIEZO2離子通道和EPAC1信號(hào)通路的關(guān)系。研究方法1將QGP-1細(xì)胞接種在Flexcell應(yīng)力加載系統(tǒng)中,使用牽張機(jī)械應(yīng)力和壓力機(jī)械應(yīng)力分別干預(yù)細(xì)胞,觀(guān)察細(xì)胞分泌5-HT的情況,確立5-HT釋放情況的量效曲線(xiàn),計(jì)算出5-HT最大釋放量時(shí)的刺激時(shí)間。2分別用PIEZO2抑制劑GsMTx4、EPAC1特異性拮抗劑ESI-09干預(yù)細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞5-HT釋放量和胞內(nèi)鈣離子濃度。研究結(jié)果1對(duì)QGP-1細(xì)胞采取循環(huán)拉伸應(yīng)力刺激和恒定壓力應(yīng)力刺激,在不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞上清液,分析5-HT含量。拉伸刺激作用于細(xì)胞120s以后,培養(yǎng)上清中5-HT含量基本趨于穩(wěn)定;在壓力刺激作用于細(xì)胞150s以后,培養(yǎng)上清中5-HT含量基本趨于穩(wěn)定。2拉伸應(yīng)力刺激后,與對(duì)照組5-HT濃度相比,陽(yáng)性對(duì)照KC1組和拉伸組的5-HT濃度顯著升高(P0.05),兩抑制劑組的5-HT濃度顯著降低(P0.05);與KC1組相比,拉伸組和兩抑制劑組5-HT濃度顯著減低(P0.05);與拉伸組相比,兩抑制劑組5-HT濃度顯著降低(P0.05);而GsMTx-4組與ESI-09組兩兩對(duì)比,組間無(wú)顯著差異。3壓力應(yīng)力刺激后,與對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照KCl組與壓力組的5-HT濃度顯著升高(P0.05),GsMTx-4組與ESI-09組的5-HT濃度顯著降低(P0.05);與KCl組相比,壓力組和各抑制劑組5-HT濃度皆顯著降低(P0.05);與壓力組相比,GsMTx-4組與ESI-09組的5-HT濃度顯著降低(P0.05);兩抑制劑組組間對(duì)比差異不顯著。4機(jī)械應(yīng)力刺激后,與對(duì)照組相比,各組鈣離子濃度皆顯著升高(P0.05)。與KCl組相比,各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度皆顯著降低(P0.05)。拉伸組、壓力組、GsMTx-4各組與ESI-09各組,組間對(duì)比無(wú)差異;與拉伸組相比,GsMTx-4組與ESI-09組鈣離子濃度顯著降低(P0.05);與壓力組相比,GsMTx-4組與ESI-09組鈣離子濃度顯著降低(P0.05)。研究結(jié)論1QGP-1細(xì)胞可以作為模擬EC細(xì)胞的模型。2EPAC1參與PIEZO2介導(dǎo)的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),協(xié)同使得胞內(nèi)鈣離子水平升高,最終導(dǎo)致5-HT的釋放。第三部分FD病證結(jié)合大鼠模型的建立及香砂六君子湯的干預(yù)機(jī)制研究研究目的以FD脾虛證大鼠模型為依托,觀(guān)測(cè)香砂六君子湯對(duì)EPAC1-PIEZO2軸及各相關(guān)指標(biāo)的影響,研究香砂六君子湯降低內(nèi)臟高敏感的機(jī)制。研究方法1采用碘乙酰胺疊加小平臺(tái)站立法建立FD脾虛證內(nèi)臟高敏感模型。2從模型大鼠一般情況、體重、飲水量和進(jìn)食量、VFH纖維實(shí)驗(yàn)、抓力、糖水偏好、血清乳酸、D-木糖、淀粉酶含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)對(duì)模型大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。3從體重、飲水量和進(jìn)食量、VFH纖維實(shí)驗(yàn)、抓力、血清乳酸、D-木糖、淀粉酶含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)和病理組織切片染色觀(guān)察香砂六君子湯對(duì)模型大鼠的影響。4使用WB方法測(cè)定各組大鼠胃底黏膜組織EPAC1蛋白和PIEZO2蛋白含量,使用Elisa方法測(cè)定胃底黏膜組織中5-HT、cAMP、鈣離子濃度含量。研究結(jié)果1與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組大鼠的體重顯著降低、進(jìn)食和飲水量、痛閾值、抓力、血清D-木糖含量和淀粉酶含量顯著降低(P0.05);血清乳酸濃度增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2中藥干預(yù)后,與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組、中藥高、中、低劑量組大鼠體重均顯著降低(P0.05),但與陽(yáng)性藥物氟西汀組相比,中藥高、中劑量組體重?zé)o顯著差異。與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組、中藥低劑量組的進(jìn)食量依舊顯著減少(P0.05)。與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組、氟西汀組、中藥高、中、低劑量組飲水量仍舊顯著減少(P0.05)。與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組、中藥中、低劑量組的痛閾值依舊顯著降低(P0.05)。與對(duì)照組相比,病證結(jié)合模型組大鼠抓力依舊顯著降低(P0.05),其他各組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。給藥后,各組大鼠血清D-木糖、淀粉酶含量顯著升高(P0.05),乳酸含量顯著降低(P0.05),與對(duì)照組相比,組間無(wú)顯著差異。HE染色顯示,各組大鼠胃底黏膜完整,形態(tài)正常,未見(jiàn)明顯充血、水腫或糜爛、潰瘍。3病癥結(jié)合模型組大鼠5-HT、cAMP水平較之對(duì)照組普遍顯著升高(P0.05),中藥干預(yù)后,各指標(biāo)趨于恢復(fù)正常水平。與病證結(jié)合模型組相比,中藥高、中劑量組大鼠胃底黏膜的EPAC1蛋白、中藥高劑量組PIEZO2蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.05);與疾病模型組相比,中藥中劑量組大鼠胃底黏膜組織中5-HT含量顯著減少(P0.05),與氟西汀組類(lèi)似。研究結(jié)論1碘乙酰胺灌胃是經(jīng)典的制作內(nèi)臟高敏感大鼠模型的造模方法。碘乙酰胺疊加小平臺(tái)站立是建立FD脾虛證大鼠模型的良好造模方法。3香砂六君子湯可通過(guò)EPAC1-PIEZO2軸干預(yù)EC細(xì)胞5-HT的釋放,從而降低內(nèi)臟高敏感的程度,其中以香砂六君子湯中劑量效果最優(yōu)。
【圖文】：

基丁？邋ＥＰＡＣ１－Ｐ丨ＥＺ０２軸探討ＥＣ在ＦＤ內(nèi)臟高敏感中的作用及香砂六]Y子湯的十偵研究熒光組織觀(guān)察逡逑置于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀(guān)察和拍攝圖片。ＦＩＴＣ激發(fā)波長(zhǎng)是４９５０５－５６５ｎｍ；邋ＴＲＩＴＣ激發(fā)波長(zhǎng)是５４３，發(fā)射波長(zhǎng)是５０５－５６５ｎｍ；邋ＤＡ發(fā)射波長(zhǎng)是４８８。逡逑結(jié)果逡逑ＨＥ染色結(jié)果逡逑下，對(duì)ＦＤ患者和正常人的胃底組織病理切片分別進(jìn)行了觀(guān)察�？梢钥椙闆r皆為良好？＿胃黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)？，腺體，未見(jiàn)充血、水腫、糜爛或潰瘍表現(xiàn)；黏膜下血管清晰。逡逑ＦＤ患者邐正常人逡逑

邐逡逑ＦＤ患者邐正常人逡逑■■逡逑圖２ＦＤ患者與正常人ＥＣ細(xì)胞免疫熒光表現(xiàn)（ＭＯＯ，邋ｂａｒ＝２５ｕｍ）逡逑３邐ＥＣ細(xì)胞－ＰＩＥＺ０２免疫熒光共定位逡逑共聚焦顯微鏡下，５－ＨＴ陽(yáng)性表達(dá)為紅色熒光染色，ＰＩＥＺ０２陽(yáng)性表達(dá)為綠色熒光染逡逑色。與正常人相比，，ＦＤ患者胃底黏膜層ＰＩＥＺ０２陽(yáng)性細(xì)胞增多。且ＥＣ細(xì)胞和ＰＩＥＺ０２逡逑可共定位。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2643881