【摘要】：背景嚴重的全身性炎癥造成的多器官損傷中,神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥可以造成比炎癥本身和其他器官損傷更為復(fù)雜的情況,而嚴重的病變更會導(dǎo)致不可逆的病殘甚至死亡。黃芪廣泛應(yīng)用于高血壓、心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、腎病綜合癥等疾病治療。研究表明黃芪注射液有增強心肌收縮力,增加冠狀血流量,保護心肌細胞、以及改善心血管功能。而其對全身性炎癥腦損傷的保護作用研究尚未見報道。本論文探討了黃芪注射液對LPS誘導(dǎo)的C57小鼠全身性炎癥腦損傷的保護作用,同時進一步研究了黃芪注射液是否基于對miR-155的調(diào)控,影響其下游信號,改變腦屏障結(jié)構(gòu)部分蛋白表達,從而保護腦屏障結(jié)構(gòu)與功能。研究結(jié)果可為黃芪注射液防治LPS所致的腦血管炎性相關(guān)疾病提供實驗依據(jù)。本研究得到了國家自然科學(xué)基金面上項目(NSFC-8107308-4、NSFC-No.81572678)和中央高校學(xué)生項目(XDJK2017D154)的支持。目的1.觀察黃芪注射液對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥損傷的保護作用,從整體的角度明確黃芪注射液是否對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的全身性炎癥腦損傷有保護作用。2.觀察黃芪注射液對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥損傷6天、17天認知功能行為學(xué)的影響,從行為學(xué)角度觀測黃芪注射液對全身性炎癥腦損傷的保護效應(yīng)。3.觀測黃芪注射液對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥腦損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響,基于其對miR-155及下游靶基因的調(diào)控,進一步探討黃芪注射液保護血腦屏障的可能機制。方法1.采用LPS(2 mg/kg)連續(xù)三天腹腔注射制備小鼠全身性炎癥模型,分為正常對照、模型組(LPS)、陽性對照(地塞米松,30 mg/kg)組,黃芪注射液低、中、高劑量(1、5、10 mL/kg,相當(dāng)于原藥材2、10、20 g/kg)組。于LPS給藥前三天開始連續(xù)給藥17天,每日一次。分別于第6天、第17天觀測:(1)小鼠攝水?dāng)z食量、體溫、體重等評價黃芪注射液對小鼠生存狀態(tài)的改善;(2)小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎重量,評價黃芪注射液對小鼠臟器指數(shù)的影響;(3)HE染色、尼氏染色觀察黃芪注射液對LPS致炎小鼠腦組織病理變化的影響。2.采用曠場實驗(Open-field test)、新物體識別實驗(New object recognition task),評測黃芪注射液對小鼠LPS損傷后認知功能的影響。3.采用經(jīng)心臟灌注Evans Blue(EB),檢測腦組織EB滲漏到血管外程度;透射電鏡觀測血腦屏障超微結(jié)構(gòu);免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀測緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin分別與血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子CD31在內(nèi)皮細胞上的共表達,從形態(tài)結(jié)構(gòu)上觀測黃芪注射液對LPS致血腦屏障損傷的保護作用。4.采用qPCR檢測Claudin-5、ZO-1、Occludin、α-actinin1、Vinculin、cateninα1、mir-155-5p及其下游基因mRNA的表達;利用WB檢測緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin和RhoA、ROCK2信號通路相關(guān)蛋白的表達,初步探討黃芪注射液對腦損傷后血腦屏障保護的可能機制。結(jié)果1.黃芪注射液改善LPS致小鼠炎性綜合征狀態(tài),減輕LPS造成的腦組織損傷黃芪注射液顯著改善LPS造成的體重下降、攝食攝水量減少、體溫下降,降低死亡率,升高存活率;減輕LPS造成的腦組織損傷,減少LPS造成的炎細胞浸潤、神經(jīng)元腫脹和神經(jīng)元壞死;第6天時,黃芪注射液降低LPS造成的腦、心、肺臟器指數(shù)上升,第17天時各組小鼠各個臟器指數(shù)均恢復(fù)。2.黃芪注射液逆轉(zhuǎn)LPS致小鼠認知行為能力下降與正常組相比,LPS連續(xù)給藥3天后,模型組小鼠的爬行格數(shù)、直立次數(shù)均顯著下降(P0.01);在第17天時,模型組小鼠新物體識別系數(shù)顯著降低(P0.05),爬行格數(shù)仍顯著下降(P0.001),直立次數(shù)減少,修飾次數(shù)、糞便粒數(shù)、中央格停留時間增加。與模型組相比,黃芪注射液10 g/kg劑量組新物體識別系數(shù)顯著升高(P0.05),地塞米松能顯著升高小鼠的爬行格數(shù)(P0.01),直立次數(shù)、修飾次數(shù)增加,糞便粒數(shù)、中央格停留時間減少。3.黃芪注射液保護LPS致血腦屏障損傷模型組C57小鼠腦組織藍染嚴重,皮質(zhì)區(qū)紅色熒光信號強,腦組織有大量EB滲漏,黃芪注射液減少腦組織EB滲漏。電鏡結(jié)果顯示黃芪注射液10 g/kg劑量組明顯拮抗LPS所致的星形膠質(zhì)細胞腫脹、內(nèi)皮細胞連接開放。4.黃芪注射液拮抗LPS致腦血管內(nèi)皮細胞之間緊密連接的表達qPCR結(jié)果顯示:第6天時,與正常組相比,LPS組降低Claudin-5(P0.01)、α-actinin1(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、Rho(P0.01)、ROCK2(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表達,升高SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.01)mRNA的表達;與模型組比較,黃芪注射液10 g/kg升高ZO-1(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.05)、cateninα1(P0.001)、ROCK2(P0.05)、PKCβ(P0.05)、mir-155-5p(P0.001)的表達,降低Claudin-5(P0.001)、Rho(P0.05)、RhoA、SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.001)、SOCS1(P0.001)mRNA的表達。第17天時,與正常組相比,LPS組降低Claudin-5(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表達,升高RhoA(P0.05)、PKCβ(P0.01)mRNA的表達;與模型組相比,黃芪注射液10 g/kg升高Claudin-5(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.05)、BCL6(P0.001)、mir-155-5p(P0.01)mRNA的表達,降低Rho(P0.05)、RhoA(P0.01)、PKCβ(P0.05)、SHIP1(P0.05)mRNA的表達。WB結(jié)果顯示,與正常組相比,第6天時,LPS損傷后顯著降低了小鼠腦組織中Claudin-5、ZO-1、Occludin、ROCK2蛋白的表達(P0.01),黃芪注射液10 g/kg升高LPS所致的Occludin、ZO-1、Claudin-5、RhoA、ROCK2蛋白表達下降。第17天時,LPS可顯著降低RhoA蛋白的表達(P0.05),黃芪注射液10 g/kg能顯著升高LPS造成的RhoA、ZO-1蛋白表達下降(P0.05),顯著降低LPS造成的ROCK2蛋白表達下降(P0.01)。結(jié)論黃芪注射液改善LPS所致的全身性炎癥損傷,改善LPS所致的認知功能下降,逆轉(zhuǎn)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞,其保護機制可能是通過mir-155-5p上調(diào)腦血管內(nèi)皮細胞間連接蛋白的表達,繼而保護全身炎癥所致的血腦屏障破壞。
【圖文】：

圖 1 給藥方案示意Fig 1. Indication of dosage plan2.3 體重、飲水、飲食、存活率及體溫監(jiān)測每天早上 9：00 對 C57 小鼠進行體重、飲水、飲食測量，記錄數(shù)據(jù)。每 12 h 對小鼠存活狀態(tài)進行觀察。于 LPS 第一次給藥后的 0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 進行肛溫測定，記錄數(shù)據(jù)。2.4 體態(tài)及臟器指數(shù)觀察于 LPS 第三次給藥后 1 h 拍照記錄 C57 小鼠體態(tài)情況并進行比對；6 d、17 d 小鼠取材前進行稱重，，脫頸處死后分別取大腦（切去嗅球和小腦）、心、肝、脾、肺、腎，生理鹽水沖洗，去除筋膜，濾紙吸干水分，稱重。C57 小鼠體重記為 M，臟器重記為 m，計算臟器指數(shù) f=m/M。2.5 石蠟切片與 HE 染色2.5.1 組織石蠟包埋切片

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文如圖 2 所示，LPS 給藥后，與正常組相比，模型組小鼠活動量減少，弓背明顯，肛周異物堵塞較多，提示動物身體狀況下降；與模型組相比，地塞米松組小鼠活動增多，弓背現(xiàn)象得到改善，肛周無異物堵塞，提示地塞米松對 LPS 所致的炎癥有保護作用；與模型組相比，黃芪注射液各劑量組小鼠活動增多，弓背現(xiàn)象得到改善，肛周異物堵塞減少，提示黃芪注射液對 LPS 所致的炎癥有保護作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭立忠;;中藥黃芪化學(xué)成份與藥理活性研究分析[J];中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理;2015年31期

2 藍明平;蔣莉;;地塞米松治療兒童化膿性腦膜炎研究進展[J];兒科藥學(xué)雜志;2015年08期

3 蘇筠霞;李建華;劉天喜;紀元春;李侃;吳蓉;郭曉超;;黃芪總黃酮對尿毒癥患者血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡的影響[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2014年18期

4 孫文連;宋恩峰;;不同劑量黃芪注射液對人腎小管上皮細胞黏附分子CD146表達的影響[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2014年02期

5 張小鴻;徐先祥;汪寧卿;;黃芪保護血管內(nèi)皮細胞作用機制研究進展[J];中國藥學(xué)雜志;2013年18期

6 任毅;戴韻峰;尹鑫;吳勝喜;郭力恒;張敏州;;益氣扶正法治療膿毒癥30例臨床觀察及其對炎癥反應(yīng)的影響[J];中醫(yī)藥導(dǎo)報;2013年08期

7 黃焰霞;劉艾然;楊毅;;內(nèi)皮細胞間黏附連接調(diào)節(jié)機制的研究進展[J];中華危重病急救醫(yī)學(xué);2013年03期

8 趙奎;;地塞米松磷酸鈉注射液在急診應(yīng)用的處方分析[J];中國醫(yī)院用藥評價與分析;2011年05期

9 曾國安;陳玉燕;李博;吳清華;;黃芪多糖對兔動脈粥樣硬化內(nèi)皮細胞功能的影響[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2010年10期

10 呂嶸;白衛(wèi)兵;王生奎;;地塞米松對兔肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2010年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張?zhí)K;人參皂苷Rb-1對LPS引起全身炎癥反應(yīng)綜合征累及腎損傷影響的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2017年

2 司靜文;基于血管新生與成熟的Hif-1α信號機制揭示黃芪甲苷Ⅳ治療心肌梗死的新機制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

3 郭曉超;黃芪總黃酮對終末期腎臟病患者血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響[D];蘭州大學(xué);2014年

4 虞林湘;黃芪多糖膠原促進血管新生與組織修復(fù)的實驗研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 鄒云;人參皂甙Rg1對膿毒癥小鼠的治療作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

6 李真真;黃芪甲苷對異丙腎上腺素所致心肌梗死的保護作用及Cx43表達的影響[D];蘭州大學(xué);2013年

7 寧雅嫻;黃芪單體毛蕊異黃酮對TNF-α損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞ET-1/的影響[D];蘭州大學(xué);2011年

8 唐柏山;毛蕊異黃酮對血管內(nèi)皮細胞ICAM-1及其受體LFA-1表達的影響[D];蘭州大學(xué);2011年

9 陳揚波;黃芪注射液對膿毒癥的臨床療效及作用機制研究[D];浙江大學(xué);2008年

10 李眺;川芎嗪、黃芪多糖及其配伍對血管內(nèi)皮細胞保護作用的研究[D];暨南大學(xué);2008年

本文編號：2642233