【摘要】：背景嚴(yán)重的全身性炎癥造成的多器官損傷中,神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥可以造成比炎癥本身和其他器官損傷更為復(fù)雜的情況,而嚴(yán)重的病變更會(huì)導(dǎo)致不可逆的病殘甚至死亡。黃芪廣泛應(yīng)用于高血壓、心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、腎病綜合癥等疾病治療。研究表明黃芪注射液有增強(qiáng)心肌收縮力,增加冠狀血流量,保護(hù)心肌細(xì)胞、以及改善心血管功能。而其對(duì)全身性炎癥腦損傷的保護(hù)作用研究尚未見報(bào)道。本論文探討了黃芪注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的C57小鼠全身性炎癥腦損傷的保護(hù)作用,同時(shí)進(jìn)一步研究了黃芪注射液是否基于對(duì)miR-155的調(diào)控,影響其下游信號(hào),改變腦屏障結(jié)構(gòu)部分蛋白表達(dá),從而保護(hù)腦屏障結(jié)構(gòu)與功能。研究結(jié)果可為黃芪注射液防治LPS所致的腦血管炎性相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(NSFC-8107308-4、NSFC-No.81572678)和中央高校學(xué)生項(xiàng)目(XDJK2017D154)的支持。目的1.觀察黃芪注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥損傷的保護(hù)作用,從整體的角度明確黃芪注射液是否對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的全身性炎癥腦損傷有保護(hù)作用。2.觀察黃芪注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥損傷6天、17天認(rèn)知功能行為學(xué)的影響,從行為學(xué)角度觀測(cè)黃芪注射液對(duì)全身性炎癥腦損傷的保護(hù)效應(yīng)。3.觀測(cè)黃芪注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠全身性炎癥腦損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響,基于其對(duì)miR-155及下游靶基因的調(diào)控,進(jìn)一步探討黃芪注射液保護(hù)血腦屏障的可能機(jī)制。方法1.采用LPS(2 mg/kg)連續(xù)三天腹腔注射制備小鼠全身性炎癥模型,分為正常對(duì)照、模型組(LPS)、陽性對(duì)照(地塞米松,30 mg/kg)組,黃芪注射液低、中、高劑量(1、5、10 mL/kg,相當(dāng)于原藥材2、10、20 g/kg)組。于LPS給藥前三天開始連續(xù)給藥17天,每日一次。分別于第6天、第17天觀測(cè):(1)小鼠攝水?dāng)z食量、體溫、體重等評(píng)價(jià)黃芪注射液對(duì)小鼠生存狀態(tài)的改善;(2)小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎重量,評(píng)價(jià)黃芪注射液對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響;(3)HE染色、尼氏染色觀察黃芪注射液對(duì)LPS致炎小鼠腦組織病理變化的影響。2.采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open-field test)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(New object recognition task),評(píng)測(cè)黃芪注射液對(duì)小鼠LPS損傷后認(rèn)知功能的影響。3.采用經(jīng)心臟灌注Evans Blue(EB),檢測(cè)腦組織EB滲漏到血管外程度;透射電鏡觀測(cè)血腦屏障超微結(jié)構(gòu);免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀測(cè)緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin分別與血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31在內(nèi)皮細(xì)胞上的共表達(dá),從形態(tài)結(jié)構(gòu)上觀測(cè)黃芪注射液對(duì)LPS致血腦屏障損傷的保護(hù)作用。4.采用qPCR檢測(cè)Claudin-5、ZO-1、Occludin、α-actinin1、Vinculin、cateninα1、mir-155-5p及其下游基因mRNA的表達(dá);利用WB檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin和RhoA、ROCK2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),初步探討黃芪注射液對(duì)腦損傷后血腦屏障保護(hù)的可能機(jī)制。結(jié)果1.黃芪注射液改善LPS致小鼠炎性綜合征狀態(tài),減輕LPS造成的腦組織損傷黃芪注射液顯著改善LPS造成的體重下降、攝食攝水量減少、體溫下降,降低死亡率,升高存活率;減輕LPS造成的腦組織損傷,減少LPS造成的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、神經(jīng)元腫脹和神經(jīng)元壞死;第6天時(shí),黃芪注射液降低LPS造成的腦、心、肺臟器指數(shù)上升,第17天時(shí)各組小鼠各個(gè)臟器指數(shù)均恢復(fù)。2.黃芪注射液逆轉(zhuǎn)LPS致小鼠認(rèn)知行為能力下降與正常組相比,LPS連續(xù)給藥3天后,模型組小鼠的爬行格數(shù)、直立次數(shù)均顯著下降(P0.01);在第17天時(shí),模型組小鼠新物體識(shí)別系數(shù)顯著降低(P0.05),爬行格數(shù)仍顯著下降(P0.001),直立次數(shù)減少,修飾次數(shù)、糞便粒數(shù)、中央格停留時(shí)間增加。與模型組相比,黃芪注射液10 g/kg劑量組新物體識(shí)別系數(shù)顯著升高(P0.05),地塞米松能顯著升高小鼠的爬行格數(shù)(P0.01),直立次數(shù)、修飾次數(shù)增加,糞便粒數(shù)、中央格停留時(shí)間減少。3.黃芪注射液保護(hù)LPS致血腦屏障損傷模型組C57小鼠腦組織藍(lán)染嚴(yán)重,皮質(zhì)區(qū)紅色熒光信號(hào)強(qiáng),腦組織有大量EB滲漏,黃芪注射液減少腦組織EB滲漏。電鏡結(jié)果顯示黃芪注射液10 g/kg劑量組明顯拮抗LPS所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、內(nèi)皮細(xì)胞連接開放。4.黃芪注射液拮抗LPS致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接的表達(dá)qPCR結(jié)果顯示:第6天時(shí),與正常組相比,LPS組降低Claudin-5(P0.01)、α-actinin1(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、Rho(P0.01)、ROCK2(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表達(dá),升高SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.01)mRNA的表達(dá);與模型組比較,黃芪注射液10 g/kg升高ZO-1(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.05)、cateninα1(P0.001)、ROCK2(P0.05)、PKCβ(P0.05)、mir-155-5p(P0.001)的表達(dá),降低Claudin-5(P0.001)、Rho(P0.05)、RhoA、SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.001)、SOCS1(P0.001)mRNA的表達(dá)。第17天時(shí),與正常組相比,LPS組降低Claudin-5(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表達(dá),升高RhoA(P0.05)、PKCβ(P0.01)mRNA的表達(dá);與模型組相比,黃芪注射液10 g/kg升高Claudin-5(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.05)、BCL6(P0.001)、mir-155-5p(P0.01)mRNA的表達(dá),降低Rho(P0.05)、RhoA(P0.01)、PKCβ(P0.05)、SHIP1(P0.05)mRNA的表達(dá)。WB結(jié)果顯示,與正常組相比,第6天時(shí),LPS損傷后顯著降低了小鼠腦組織中Claudin-5、ZO-1、Occludin、ROCK2蛋白的表達(dá)(P0.01),黃芪注射液10 g/kg升高LPS所致的Occludin、ZO-1、Claudin-5、RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)下降。第17天時(shí),LPS可顯著降低RhoA蛋白的表達(dá)(P0.05),黃芪注射液10 g/kg能顯著升高LPS造成的RhoA、ZO-1蛋白表達(dá)下降(P0.05),顯著降低LPS造成的ROCK2蛋白表達(dá)下降(P0.01)。結(jié)論黃芪注射液改善LPS所致的全身性炎癥損傷,改善LPS所致的認(rèn)知功能下降,逆轉(zhuǎn)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞,其保護(hù)機(jī)制可能是通過mir-155-5p上調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá),繼而保護(hù)全身炎癥所致的血腦屏障破壞。
【圖文】：

圖 1 給藥方案示意Fig 1. Indication of dosage plan2.3 體重、飲水、飲食、存活率及體溫監(jiān)測(cè)每天早上 9：00 對(duì) C57 小鼠進(jìn)行體重、飲水、飲食測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)。每 12 h 對(duì)小鼠存活狀態(tài)進(jìn)行觀察。于 LPS 第一次給藥后的 0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 進(jìn)行肛溫測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)。2.4 體態(tài)及臟器指數(shù)觀察于 LPS 第三次給藥后 1 h 拍照記錄 C57 小鼠體態(tài)情況并進(jìn)行比對(duì)；6 d、17 d 小鼠取材前進(jìn)行稱重，，脫頸處死后分別取大腦（切去嗅球和小腦）、心、肝、脾、肺、腎，生理鹽水沖洗，去除筋膜，濾紙吸干水分，稱重。C57 小鼠體重記為 M，臟器重記為 m，計(jì)算臟器指數(shù) f=m/M。2.5 石蠟切片與 HE 染色2.5.1 組織石蠟包埋切片

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文如圖 2 所示，LPS 給藥后，與正常組相比，模型組小鼠活動(dòng)量減少，弓背明顯，肛周異物堵塞較多，提示動(dòng)物身體狀況下降；與模型組相比，地塞米松組小鼠活動(dòng)增多，弓背現(xiàn)象得到改善，肛周無異物堵塞，提示地塞米松對(duì) LPS 所致的炎癥有保護(hù)作用；與模型組相比，黃芪注射液各劑量組小鼠活動(dòng)增多，弓背現(xiàn)象得到改善，肛周異物堵塞減少，提示黃芪注射液對(duì) LPS 所致的炎癥有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2642233