【摘要】：背景業(yè)已表明,氧化應(yīng)激、線粒體缺陷以及炎癥反應(yīng)參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生過(guò)程,例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等。AD的典型病理學(xué)特征為患者腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑(senile plaques,SP)、腦神經(jīng)纖維樣纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)及選擇性神經(jīng)細(xì)胞死亡。腦內(nèi)老年斑內(nèi)沉積的主要是Aβ蛋白(Amyloid beta protein)。與PD相關(guān)的α-synuclein蛋白(α-syn),是Lewy小體的主要組份。細(xì)胞內(nèi)α-syn的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致線粒體氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生和線粒體結(jié)構(gòu)與功能異常。在AD、PD發(fā)病過(guò)程中,線粒體損傷是重要環(huán)節(jié),而靶向線粒體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制鮮有報(bào)道。積雪草酸(asiatic acid,AA)是積雪草的提取物,系五環(huán)三萜烯類(lèi)化合物,具有清除自由基和保護(hù)線粒體之功效,可防治抑郁癥。我們以前的研究發(fā)現(xiàn),AA還具有神經(jīng)保護(hù)作用,但其機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide),是穿心蓮的主要活性成分,其可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞周期和凋亡,具有抗瘤活性,還能對(duì)抗氧化應(yīng)激、改善小鼠糖尿病性癡呆。此外,在APP/PS1老年癡呆小鼠,穿心蓮內(nèi)酯能夠保護(hù)突觸的可塑性,促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(longterm potentiation,LTP)抑制長(zhǎng)時(shí)程抑制(longterm depression,LTD),改善AD癥狀,并通過(guò)活化Wnt促進(jìn)APP/PS1小鼠神經(jīng)元再生,抑制GSK-3β緩解了神經(jīng)退行性疾病,然而其機(jī)制卻不詳。目的鑒于氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂和炎癥是AD和PD發(fā)生的重要因素,保護(hù)線粒體、緩解氧化應(yīng)激和抑制炎癥對(duì)防治此類(lèi)疾病具有重要意義。我們前期的研究表明,積雪草酸及穿心蓮內(nèi)酯都可以對(duì)線粒體有一定保護(hù)作用,積雪草酸可以通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜電位來(lái)保護(hù)線粒體,穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體自噬而保護(hù)線粒體穩(wěn)態(tài)、抑制非可控性炎癥時(shí)炎癥小體的活化;穿心蓮內(nèi)酯還能夠清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS),保護(hù)大鼠腦線粒體,或通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上,本論文擬通過(guò)建立AD、PD在體和離體模型,應(yīng)用積雪草酸等藥物進(jìn)行干預(yù),借此分析積雪草酸及穿心蓮內(nèi)酯在改善AD、PD癥狀中的作用,探討通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化來(lái)防治AD、PD的可能性,從線粒體水平揭示神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的可能機(jī)制,尋找合適的干預(yù)靶點(diǎn)。方法1、線粒體缺陷細(xì)胞氧化損傷模型的誘導(dǎo):使用疊氮鈉(Sodium Azide,Na N3)作為線粒體電子傳遞鏈細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)的特異性抑制劑,以魚(yú)藤酮(Rotenone)作為線粒體呼吸傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ的抑制劑,再聯(lián)合使用H2O2誘導(dǎo)線粒體缺陷的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷;直接應(yīng)用Aβ?lián)p傷細(xì)胞,模擬AD、PD時(shí)線粒體缺陷神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)度氧化刺激下,引發(fā)特定腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷的過(guò)程。2、細(xì)胞活性和線粒體功能的分析:細(xì)胞活性檢測(cè)采用MTT法;通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué);流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的變化。綜合應(yīng)用上述方法觀察該模型中神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體的變化,及AA和穿心蓮內(nèi)酯調(diào)控線粒體、保護(hù)神經(jīng)元和調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的作用。(1)在疊氮鈉、魚(yú)藤酮等誘導(dǎo)的線粒體輕度損傷模型(模擬AD、PD早期)中,用Mitotracker red熒光染料分析線粒體數(shù)目,DCFHDA熒光染料檢測(cè)ROS的生成,接著用MTT法檢測(cè)AA對(duì)急性魚(yú)藤酮損傷的細(xì)胞存活率的影響。此外,在疊氮鈉誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中,還檢測(cè)了線粒體膜電位,加入AA后檢測(cè)同樣指標(biāo),以評(píng)價(jià)AA神經(jīng)保護(hù)作用的線粒體機(jī)制。(2)在PD離體實(shí)驗(yàn)中,以魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y細(xì)胞為模型,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率和凋亡,探討穿心蓮內(nèi)酯對(duì)魚(yú)藤酮損傷的抵抗作用。檢測(cè)指標(biāo)包括:氧化應(yīng)激和線粒體膜電位、線粒體耗氧、ATP含量和線粒體形態(tài)等。大致過(guò)程為:以不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h,加入30μmol/L Rotenone作用6 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性;Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;DCFH-DA染色分析細(xì)胞內(nèi)ROS;JC-1染色觀察細(xì)胞線粒體膜電位的改變;熒光素酶法檢測(cè)ATP的含量;Clark氧電極檢測(cè)線粒體的呼吸功能;應(yīng)用MDA和SOD試劑盒測(cè)定細(xì)胞MDA和SOD的含量,以分析細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外,用Mito Tracker green染色作流式細(xì)胞分析,檢測(cè)線粒體數(shù)目變化。通過(guò)上述分析,探討穿心蓮內(nèi)酯對(duì)線粒體損傷的保護(hù)和維持線粒體形態(tài)的機(jī)制。3、小鼠PD樣模型的建立及行為觀察:采用MPTP構(gòu)建PD樣小鼠模型,分析穿心蓮內(nèi)酯對(duì)PD模型鼠行為改善的影響。首先采用開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)、懸掛試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)檢測(cè)小鼠的行為變化,繼而取中腦組織檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和線粒體拷貝數(shù),以探討穿心蓮內(nèi)酯改善PD模型鼠運(yùn)動(dòng)行為的相關(guān)機(jī)制。(1)小鼠帕金森病建模:連續(xù)5天腹腔注射25 mg/kg MPTP進(jìn)行模型誘導(dǎo),干預(yù)組在誘模的同時(shí)腹腔注射2.5 mg/kg和5 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯,連續(xù)12天。(2)小鼠在體試驗(yàn):采用開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)、轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳、懸掛試驗(yàn)觀察小鼠運(yùn)動(dòng)行為的改變。采用Western Blot和免疫組化法分析黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶的表達(dá);Nissl染色法檢測(cè)腦蛋白合成功能;用MDA、SOD和Catalase試劑盒分析小鼠黑質(zhì)部氧化應(yīng)激水平;用TUNEL染色法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)部神經(jīng)元凋亡情況;以ELISA檢測(cè)外周血炎癥因子的表達(dá)水平;quantity Real-time PCR測(cè)定小鼠腦區(qū)炎癥因子的m RNA表達(dá)水平;免疫熒光染色法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志Iba-1。(3)在離體試驗(yàn)中:以不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h后,加入30μmol/L Rotenone作用6 h,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性;Annexin-V/PI雙染法分析細(xì)胞凋亡率;DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS;JC-1染色分析細(xì)胞線粒體膜電位的變化;熒光素酶法分析ATP含量;Clark氧電極檢測(cè)線粒體呼吸功能。此外,MDA和SOD試劑盒分析細(xì)胞MDA、SOD含量,以了解細(xì)胞氧化應(yīng)激。Mito Tracker green染色后流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)線粒體數(shù)目,quantity Real-time PCR分析線粒體拷貝數(shù)的變化。4、在AD模型中:用不同濃度(1、10、100 nmol/L)的AA預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24h,然后加入Aβ1-42(10μmol/L)作用24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,建立細(xì)胞模型。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,流式細(xì)胞分析和Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,JC-1染色法觀察線粒體膜電位,熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量。此外,我們觀察了AA對(duì)PD果蠅攀爬能力和壽命的影響,檢測(cè)了AA對(duì)PD果蠅體內(nèi)MDA和GSH的水平的影響。結(jié)果1.SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和線粒體損傷模型的建立。結(jié)果表明,對(duì)于SH-SY5Y細(xì)胞,H2O2、魚(yú)藤酮和疊氮鈉濃度分別達(dá)300μmol/L、10 nmol/L和15 mmol/L時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生明顯損傷,且在一定范圍內(nèi),損傷的程度與藥物呈劑量依賴(lài)關(guān)系。形態(tài)學(xué)觀察也顯示,隨著藥物濃度的增加,SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為從突起減少到消失、胞體皺縮等。2.AA對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD樣細(xì)胞損傷具有明顯的干預(yù)作用。(1)AA可通過(guò)穩(wěn)定線粒體的膜電位發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在魚(yú)藤酮損傷的細(xì)胞中,加入AA能對(duì)抗線粒體膜電位的去極化和ROS的增加、抑制BAX的上調(diào)。應(yīng)用本研究分別建立的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和線粒體損傷模型,初步觀察了AA的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果表明,在H2O2刺激SH-SY5Y細(xì)胞前24 h,給予不同劑量的AA可抵抗300μmol/L H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷。另外,AA也可對(duì)抗Na N3或Na N3+H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位發(fā)現(xiàn),AA可減緩損傷細(xì)胞線粒體膜電位的下降。這一結(jié)果提示,AA的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與穩(wěn)定線粒體的膜電位有關(guān)。(2)AA通過(guò)抑制α-syn過(guò)表達(dá)、線粒體轉(zhuǎn)位和Cyto C釋放,下調(diào)ROS和BAX等發(fā)揮線粒體保護(hù)作用。在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的線粒體損傷模型:0.01 100 nmol/L AA可影響100 nmol/L魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD樣細(xì)胞損傷。AA可對(duì)抗魚(yú)藤酮損傷的細(xì)胞線粒體膜電位去極化和ROS增加,抑制BAX的上調(diào)。在α-syn過(guò)表達(dá)的PD果蠅模型:0.5-2 mg AA/100g培養(yǎng)基能顯著提高果蠅的攀爬能力,延長(zhǎng)其壽命,PD果蠅體內(nèi)MDA含量明顯降低,GSH含量顯著升高,這可能與AA抗氧化作用有關(guān)。在α-syn誘導(dǎo)的離體小鼠腦線粒體損傷模型:AA能逆轉(zhuǎn)α-syn引起的線粒體膜電位的下降,穩(wěn)定膜的完整性和ATP的合成,抑制ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。AA的保護(hù)作用與其阻止α-syn線粒體轉(zhuǎn)位相關(guān)。此外,在小鼠帕金森病模型中,我們發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可改善PD樣小鼠的運(yùn)動(dòng)功能,表現(xiàn)為給藥后能提高PD樣小鼠在開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)距離和在中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間,縮短爬桿時(shí)間和延長(zhǎng)轉(zhuǎn)輪平衡時(shí)間,提高強(qiáng)迫游泳時(shí)PD樣小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力以及懸掛試驗(yàn)中的抓握能力。同時(shí),能夠改善黑質(zhì)部分氧化應(yīng)激水平和炎癥因子表達(dá)水平。結(jié)論本研究應(yīng)用AD、PD模型檢測(cè)了線粒體功能、Cyto C和α-syn的表達(dá),探討AA或穿心蓮內(nèi)酯對(duì)抗Aβ、α-syn或MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的線粒體機(jī)制,積雪草酸可通過(guò)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、保護(hù)線粒體功能和增加線粒體數(shù)目等作用對(duì)抗疊氮鈉和Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。穿心蓮內(nèi)酯具有保護(hù)線粒體對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用,顯示其治療PD的潛力。研究結(jié)果提示,線粒體在AD、PD發(fā)病過(guò)程中具有重要作用,以線粒體為靶向的藥物AA及穿心蓮內(nèi)酯可作為防治AD、PD的候選藥物,有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值。線粒體可以作為研究神經(jīng)退行性疾病機(jī)制的一個(gè)重要靶點(diǎn),為抗氧化及炎癥因子損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能,預(yù)防PD和AD提供新的研究思路。
【圖文】：

線粒體功能的級(jí)聯(lián)假說(shuō)[46]

PD發(fā)生的機(jī)制[74]
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2641355