【摘要】：第一部分過(guò)載力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡模型的建立目的:通過(guò)探究過(guò)載力持續(xù)時(shí)間及加載周期對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響,建立應(yīng)力性骨折的成骨細(xì)胞凋亡模型。方法:1實(shí)驗(yàn)分組:將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為7組:對(duì)照組,每天加載0.5h持續(xù)4d組,每天加載0.5h持續(xù)8d組,每天加載0.5h持續(xù)12d組,每天加載2h持續(xù)4d組,每天加載2h持續(xù)8d組,每天加載2h持續(xù)12d組。2有限元分析細(xì)胞支架復(fù)合物受力分布情況。3 Hoechst/PI熒光雙染法觀察支架-細(xì)胞復(fù)合物成骨細(xì)胞凋亡情況。4采用CCK-8試劑盒檢測(cè)三維培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖活性。5采用AKP、LDH和Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定成骨細(xì)胞分化、乳酸脫氫酶的外漏量及凋亡標(biāo)志物Caspase-3活性。6 Realtime RT-PCR方法檢測(cè)Caspase-3,9的基因表達(dá)水平。7 Western Blot方法檢測(cè)Caspase-3,9的蛋白水平。結(jié)果:1當(dāng)表觀應(yīng)變?yōu)?0000με時(shí),4000με以上應(yīng)變占60%,因此在三維過(guò)載力學(xué)培養(yǎng)環(huán)節(jié),選擇表觀應(yīng)變?yōu)?0000με的力學(xué)加載強(qiáng)度。2在熒光顯微鏡下可觀察到,對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)紅染細(xì)胞;每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組以及每天加載2h持續(xù)4d組細(xì)胞核形態(tài)與對(duì)照組大致相同,可見(jiàn)少量紅色死亡細(xì)胞;每天加載0.5h持續(xù)12d以及每天加載2h持續(xù)8d和12d組可見(jiàn)凋亡小體并且可見(jiàn)大量紅色死亡細(xì)胞。3每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組和每天加載2h持續(xù)4d組,CCK-8檢測(cè)OD值顯著升高(P0.05),而每天加載0.5h,持續(xù)12d組和每天加載2h,持續(xù)8d、12d組,OD值顯著下降(P0.05)。力學(xué)加載前8d,每天加載0.5h組OD值明顯高于2h組(P0.05),而加載至12d時(shí),兩組別無(wú)顯著性差異(P0.05)。4正常對(duì)照組與0.5h、2h組AKP表達(dá)量有顯著性差異(P0.05),0.5h組與2h組之間AKP表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P0.05);4d、8d、12d與0d相比AKP表達(dá)量均升高,4d與8d之間表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而12d比其余組均升高(P0.05)。5正常對(duì)照組、0.5h及2h三組LDH外漏量均有顯著性差異(P0.05),2h組明顯高于正常對(duì)照組和0.5h組;0、4、8、12d四組LDH外漏量均有顯著性差異(P0.05)。6與加載0d組相比,除每天加載0.5h,持續(xù)4d組之外,其余各組Caspase-3活性均升高(P0.05);持續(xù)加載至第4天時(shí),每天加載2h組Caspase-3活性顯著高于0.5h組(P0.05),其余每天兩時(shí)間點(diǎn)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);0.5h組在第8天開(kāi)始Caspase-3活性顯著升高,在第12天與2h組無(wú)差異。7與正常對(duì)照組相比,各力學(xué)加載組caspase-3基因表達(dá)量明顯升高(P0.05),加載4d時(shí)每天加載2h組caspase-3基因表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組;與正常對(duì)照組相比,各力學(xué)加載組caspase-9基因表達(dá)量明顯升高(P0.05),加載8d時(shí)每天加載2h組caspase-9基因表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組。8與正常對(duì)照組相比,模型組加載第8、12天,caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高,且每天加載2h各組蛋白表達(dá)量明顯高于每天加載0.5h組。第二部分過(guò)載力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究目的:通過(guò)研究過(guò)載力作用下細(xì)胞膜上鈣離子通道、細(xì)胞外ATP濃度對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡的影響,探討應(yīng)力性骨折的發(fā)病機(jī)制。方法:1實(shí)驗(yàn)分組:隨機(jī)取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為不受力組(正常對(duì)照組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基),加入維拉帕米組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基),Hank?s培養(yǎng)基對(duì)照組,Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組),過(guò)載力加載1天組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基組,Hank?s培養(yǎng)基組,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組,Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組),過(guò)載力加載8天組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入NEM組)。2 Fluo-4-AM熒光標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。3 ATP活性測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞外ATP活性。4 Realtime RT-PCR方法測(cè)定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因表達(dá)量。5 Western Blot方法測(cè)定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)量。結(jié)果:1每天加載過(guò)載力2h,第一天細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度及細(xì)胞外ATP含量均顯著高于正常對(duì)照組(P0.05),第二天ATP含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P0.05),第三天開(kāi)始ATP含量顯著低于正常對(duì)照組(P0.05)。除第四天外,其余各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著升高(P0.05),且呈時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。2過(guò)載力作用1d,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和ATP含量顯著升高,加入細(xì)胞胞吐作用抑制劑NEM可以顯著抑制這種效應(yīng)。加入鈣離子通道阻斷劑維拉帕米(細(xì)胞膜上)可以降低細(xì)胞外ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(P0.05)。3過(guò)載力作用第8天,加入NEM對(duì)細(xì)胞外ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P0.05);但加入維拉帕米后,細(xì)胞外ATP含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與對(duì)照組相比顯著降低(P0.05)。4過(guò)載力作用第8天,細(xì)胞Caspase-3,Caspase-9以及Bax/Bcl-2比值的蛋白及m RNA表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組(P0.05),維拉帕米可以顯著下調(diào)在過(guò)載力環(huán)境下的細(xì)胞內(nèi)凋亡基因及蛋白的表達(dá)(P0.05),但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)顯著影響。第三部分野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡及機(jī)制目的:通過(guò)研究過(guò)載力作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,探討野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力刺激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。方法:1實(shí)驗(yàn)分組:本部分實(shí)驗(yàn)在研究不同濃度野薔薇苷對(duì)過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡模型的作用時(shí),將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為6組,分別為:正常對(duì)照組(不加力),過(guò)載力加載模型組,野薔薇苷濃度為1×10-6mol/L組、1×10-8 mol/L組、1×10-10 mol/L組和1×10-12 mol/L組,均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h,持續(xù)8d;在研究野薔薇苷對(duì)抗過(guò)載力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制時(shí),將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞支架復(fù)合物分為4組,分別為正常對(duì)照組,過(guò)載力加載模型組,維拉帕米(1×10-8 mol/L)組,野薔薇苷(1×10-8 mol/L)組,對(duì)照組不做力學(xué)加載,在同樣條件下培養(yǎng)8d,其余3組均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h,持續(xù)8d。2 Hoechst/PI熒光雙染法觀察野薔薇苷抗凋亡作用。3采用CCK-8方法測(cè)定OD值評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。4測(cè)定Caspase-3活性評(píng)價(jià)野薔薇苷抗凋亡基因活化情況。5測(cè)定LDH外漏量評(píng)價(jià)不同條件下細(xì)胞損傷情況。6測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度評(píng)價(jià)野薔薇苷抗凋亡機(jī)制。7 Realtime RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2和Bax基因表達(dá)情況。8 Western Blot方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Caspase-9,Caspase-3,Cyt-C,Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1熒光顯微鏡下可見(jiàn),正常對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)紅染細(xì)胞;過(guò)載力加載模型組可見(jiàn)細(xì)胞核皺縮,細(xì)胞形狀不規(guī)整,出現(xiàn)凋亡小體并且可見(jiàn)大量紅染細(xì)胞;與模型組相比,各加藥組尤其是野薔薇苷1×10-8 mol/L和1×10-10mol/L組紅染細(xì)胞數(shù)量明顯減少。2與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組顯著降低(P0.05),與模型組相比,各濃度野薔薇苷均能顯著升高細(xì)胞活力(P0.05),其中1×10-10mol/L組最高。3各濃度野薔薇苷組LDH值均顯著低于模型組(P0.05)。4與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組Caspase-3活性顯著升高(P0.05);加入野薔薇苷可明顯降低Caspase-3活化程度(P0.05);其中1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組Caspase-3活性低于1×10-6 mol/L和1×10-12 mol/L組。5與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組Caspase-3和Caspase-9 m RNA及其蛋白水平明顯升高(P0.05);加入野薔薇苷后Caspase-3和Caspase-9m RNA和蛋白水平明顯降低(P0.05)。6與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高(P0.05),維拉帕米和野薔薇苷均能阻止細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高(P0.05)。7與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組Caspase-3,Caspase-9 m RNA表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2的比值均顯著升高(P0.05);與模型組相比,維拉帕米組除Caspase-9外,其余均顯著性降低(P0.05);野薔薇苷組Caspase-3,Caspase-9 m RNA表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2的比值與模型組均顯著性降低(P0.05)。8與對(duì)照組相比,過(guò)載力加載模型組細(xì)胞Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平顯著升高,Bcl-2顯著降低;與模型組相比,維拉帕米組和野薔薇苷組Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平顯著降低,Bcl-2蛋白水平顯著升高。結(jié)論:1過(guò)載力刺激對(duì)成骨細(xì)胞有“雙向刺激”作用,短期作用能刺激成骨細(xì)胞增殖分化,長(zhǎng)期作用則導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡。2短期過(guò)載力刺激促進(jìn)細(xì)胞膜上鈣離子通道的開(kāi)放和促進(jìn)ATP向基質(zhì)分泌,共同促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,長(zhǎng)期過(guò)載力刺激僅作用于細(xì)胞膜上鈣離子通道的開(kāi)放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載。3適當(dāng)濃度的野薔薇苷能有效降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,下調(diào)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá),對(duì)抗長(zhǎng)期過(guò)載力刺激導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

圖 1 有限元分析不同表觀應(yīng)力下 PCL 材料應(yīng)力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.

圖 1 有限元分析不同表觀應(yīng)力下 PCL 材料應(yīng)力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 袁長(zhǎng)青,丁振華;Caspase的結(jié)構(gòu)與功能[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2002年03期

2 張順業(yè),孫宗全,劉立新,哈斯朝努;Carvedilol attenuates CPB-induced apoptosis in dog heart: regulation of Fas/FasL and caspase-3 pathway[J];Chinese Medical Journal;2003年05期

3 姚克,王凱軍,徐雯,孫朝暉,申屠形超,邱培瑾;Caspase-3 and its inhibitor Ac-DEVD-CHO in rat lens epithelial cell apoptosis induced by hydrogen in vitro[J];Chinese Medical Journal;2003年07期

4 鄭廣瑛,張成,李志剛;Early activation of caspase-1 after retinal ischemia and reperfusion injury in mice[J];Chinese Medical Journal;2004年05期

5 張曉華,李兆申,屠振興,許國(guó)銘,龔燕芳,滿(mǎn)曉華;Therapeutic effect of Caspase-1 inhibitor on liver injury in experimental severe acute pancreatitis[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2004年02期

6 高慧;鄒麗;;The Effects of Magnesium Sulfate on Fetal Rats of FGR and the Expression of Caspase-3 in the Placenta of Maternal Rat[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年06期

7 屈軍樂(lè);潘文良;趙伶羚;孫磊;王小平;陳同生;;蟾酥靈誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化特性熒光分析[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版);2008年03期

8 ;Analysis of in vivo patterns of caspase 3 gene expression in primary hepatocellular carcinoma and its relationship to p21~(WAF1) expression and hepatic apoptosis[J];World Journal of Gastroenterology;2000年03期

9 徐人歡 ,劉靜 ,徐豐 ,江舸 ,謝青 ,周霞秋 ,金由辛 ,王德寶;Activity identification of chimeric anti-caspase-3 mRNA hammerhead ribozyme in vitro and in vivo[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2001年06期

10 黃偉;Caspase研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);2001年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 Qiang Su;Lang Li;Yang-chun Liu;You Zhou;;Effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization in rats[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)心血管病學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2013年

2 韓志君;蔣廷旺;唐裕杰;胡志德;孫懿;周曄;陳燕;谷明莉;鄧安梅;仲人前;;Caspase在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)及其臨床意義[A];全國(guó)臨床免疫檢驗(yàn)研討會(huì)暨第六屆全國(guó)臨床免疫學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 葉月芳;周韌;;漢族人群caspase-10基因中可能存在一個(gè)新的微衛(wèi)星位點(diǎn)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

4 ;Effect of atorvastatin on myocardial apoptosis and caspase-8 activation following coronary microembolization[A];第十三次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

5 ;The Effect of Theanine on the Expression of Survivin,Bax,Caspase-3 in the Hippocampus and the Ability of Spatial Learning and Memory after Global Cerebral Ischemia /Reperfusion in Rats[A];全國(guó)第三次麻醉藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

6 Ki Seong Eom;Gil-Saeng Jeong;Tae Young Kim;;Ophiobolin B inhibits proliferation of glioblastoma U87MG cells by inducing S phase arrest and caspase-dependent apoptosis[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)神經(jīng)腫瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第八屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

7 鄧常清;唐映紅;李花;陳北陽(yáng);陳瑞芬;;補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效部位對(duì)局灶性腦缺血再灌注后caspase表達(dá)的作用[A];第六次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合血瘀證及活血化瘀研究學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2005年

8 鄭世營(yíng);葛錦峰;趙軍;蔣東;紀(jì)勇;邵峰;;Caspase活化的細(xì)胞凋亡在老年非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

9 吳小候;李俊;;Expression of TRAIL and caspase 3 and their significance in rat’s renal ischemia-reperfusion injury[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

10 朱秋華;江煥峰;李佳;劉叔文;;新型Caspase-3抑制劑二氫吡咯衍生物的研究[A];第十屆全國(guó)抗炎免疫藥理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 一帆;caspase—8缺陷導(dǎo)致免疫紊亂[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張放;阻斷NLRP3炎癥小體中Caspase-1活化治療小鼠急性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 程進(jìn);蛋白激酶C在腫瘤再增殖中的作用及作用機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

3 唐楊順;Caspase-1在熱驚厥發(fā)生中的作用及以Caspase-1為靶點(diǎn)的新型小分子抑制劑研究[D];浙江大學(xué);2016年

4 胡瑩;瀉火化瘀通竅法對(duì)耳蝸IRI模型大鼠Caspase-9/6及Bax/Bcl-2影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2016年

5 楊杰凌;三型分泌系統(tǒng)針狀蛋白和梭菌大毒素激活炎癥小體的分子機(jī)制[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 賽佳明;慢病毒GV115-Survivin轉(zhuǎn)染反分化椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)以及GV115-Caspase3 siRNA的構(gòu)建及其生物學(xué)效應(yīng)[D];青島大學(xué);2016年

7 張曉芳;體內(nèi)外研究CXCL1誘導(dǎo)以caspase-3為依賴(lài)的微管相關(guān)蛋白Tau的剪切[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2016年

8 謝金鑫;豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A切割的機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2016年

9 朱叢中;Survivin顯性負(fù)性突變體和miR-24對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

10 林居強(qiáng);細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase蛋白酶激活的光學(xué)成像研究[D];華中科技大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 薛子成;樺木酸及其衍生物與Caspase-3分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)研究[D];哈爾濱理工大學(xué);2014年

2 臧韻;TTF1-NP通過(guò)活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的Caspase通路抑制大鼠原發(fā)性肝癌的生長(zhǎng)[D];延邊大學(xué);2015年

3 胡麗華;四氯苯醌激活Caspase 8/t-Bid誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路分析[D];西南大學(xué);2015年

4 董娜;Nestin和活化型caspase-3在狼掩性腎炎腎小球中的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 常貫超;klotho蛋白、Caspase12蛋白在糖尿病腎病中的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 徐彥楠;異牛肝菌素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 武辰楠;沙利度胺對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和BAX mRNA的表達(dá)影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 陳素艷;不同時(shí)間和濃度的常壓氧對(duì)大鼠腦缺血半暗帶細(xì)胞凋亡的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

9 閆文相;Nrf2、Caspase3在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)性[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 劉麗;失僂剌知丸對(duì)腦缺血大鼠再灌注后Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2639411