發(fā)布時間：2020-04-24 21:16

【摘要】：第一部分過載力誘導(dǎo)成骨細胞凋亡模型的建立目的:通過探究過載力持續(xù)時間及加載周期對成骨細胞凋亡的影響,建立應(yīng)力性骨折的成骨細胞凋亡模型。方法:1實驗分組:將生長狀況良好的細胞支架復(fù)合物分為7組:對照組,每天加載0.5h持續(xù)4d組,每天加載0.5h持續(xù)8d組,每天加載0.5h持續(xù)12d組,每天加載2h持續(xù)4d組,每天加載2h持續(xù)8d組,每天加載2h持續(xù)12d組。2有限元分析細胞支架復(fù)合物受力分布情況。3 Hoechst/PI熒光雙染法觀察支架-細胞復(fù)合物成骨細胞凋亡情況。4采用CCK-8試劑盒檢測三維培養(yǎng)成骨細胞增殖活性。5采用AKP、LDH和Caspase-3活性檢測試劑盒測定成骨細胞分化、乳酸脫氫酶的外漏量及凋亡標志物Caspase-3活性。6 Realtime RT-PCR方法檢測Caspase-3,9的基因表達水平。7 Western Blot方法檢測Caspase-3,9的蛋白水平。結(jié)果:1當(dāng)表觀應(yīng)變?yōu)?0000με時,4000με以上應(yīng)變占60%,因此在三維過載力學(xué)培養(yǎng)環(huán)節(jié),選擇表觀應(yīng)變?yōu)?0000με的力學(xué)加載強度。2在熒光顯微鏡下可觀察到,對照組細胞偶見紅染細胞;每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組以及每天加載2h持續(xù)4d組細胞核形態(tài)與對照組大致相同,可見少量紅色死亡細胞;每天加載0.5h持續(xù)12d以及每天加載2h持續(xù)8d和12d組可見凋亡小體并且可見大量紅色死亡細胞。3每天加載0.5h持續(xù)4d、8d組和每天加載2h持續(xù)4d組,CCK-8檢測OD值顯著升高(P0.05),而每天加載0.5h,持續(xù)12d組和每天加載2h,持續(xù)8d、12d組,OD值顯著下降(P0.05)。力學(xué)加載前8d,每天加載0.5h組OD值明顯高于2h組(P0.05),而加載至12d時,兩組別無顯著性差異(P0.05)。4正常對照組與0.5h、2h組AKP表達量有顯著性差異(P0.05),0.5h組與2h組之間AKP表達量無顯著性差異(P0.05);4d、8d、12d與0d相比AKP表達量均升高,4d與8d之間表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而12d比其余組均升高(P0.05)。5正常對照組、0.5h及2h三組LDH外漏量均有顯著性差異(P0.05),2h組明顯高于正常對照組和0.5h組;0、4、8、12d四組LDH外漏量均有顯著性差異(P0.05)。6與加載0d組相比,除每天加載0.5h,持續(xù)4d組之外,其余各組Caspase-3活性均升高(P0.05);持續(xù)加載至第4天時,每天加載2h組Caspase-3活性顯著高于0.5h組(P0.05),其余每天兩時間點間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);0.5h組在第8天開始Caspase-3活性顯著升高,在第12天與2h組無差異。7與正常對照組相比,各力學(xué)加載組caspase-3基因表達量明顯升高(P0.05),加載4d時每天加載2h組caspase-3基因表達量明顯高于每天加載0.5h組;與正常對照組相比,各力學(xué)加載組caspase-9基因表達量明顯升高(P0.05),加載8d時每天加載2h組caspase-9基因表達量明顯高于每天加載0.5h組。8與正常對照組相比,模型組加載第8、12天,caspase-9、caspase-3蛋白表達量明顯升高,且每天加載2h各組蛋白表達量明顯高于每天加載0.5h組。第二部分過載力誘導(dǎo)成骨細胞凋亡的機制研究目的:通過研究過載力作用下細胞膜上鈣離子通道、細胞外ATP濃度對細胞內(nèi)鈣離子濃度及細胞凋亡的影響,探討應(yīng)力性骨折的發(fā)病機制。方法:1實驗分組:隨機取生長狀況良好的細胞支架復(fù)合物分為不受力組(正常對照組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基),加入維拉帕米組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基),Hank?s培養(yǎng)基對照組,Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組),過載力加載1天組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基組,Hank?s培養(yǎng)基組,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組,Hank?s培養(yǎng)基中加入NEM組),過載力加載8天組(分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入維拉帕米組,分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入NEM組)。2 Fluo-4-AM熒光標記法測定細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。3 ATP活性測定試劑盒測定細胞外ATP活性。4 Realtime RT-PCR方法測定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因表達量。5 Western Blot方法測定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達量。結(jié)果:1每天加載過載力2h,第一天細胞內(nèi)游離鈣離子濃度及細胞外ATP含量均顯著高于正常對照組(P0.05),第二天ATP含量與正常對照組無顯著性差異(P0.05),第三天開始ATP含量顯著低于正常對照組(P0.05)。除第四天外,其余各時間點細胞內(nèi)鈣離子濃度均顯著升高(P0.05),且呈時間依賴趨勢。2過載力作用1d,細胞內(nèi)鈣離子濃度和ATP含量顯著升高,加入細胞胞吐作用抑制劑NEM可以顯著抑制這種效應(yīng)。加入鈣離子通道阻斷劑維拉帕米(細胞膜上)可以降低細胞外ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度(P0.05)。3過載力作用第8天,加入NEM對細胞外ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度影響與對照組相比無顯著性差異(P0.05);但加入維拉帕米后,細胞外ATP含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度與對照組相比顯著降低(P0.05)。4過載力作用第8天,細胞Caspase-3,Caspase-9以及Bax/Bcl-2比值的蛋白及m RNA表達量均顯著高于正常對照組(P0.05),維拉帕米可以顯著下調(diào)在過載力環(huán)境下的細胞內(nèi)凋亡基因及蛋白的表達(P0.05),但對正常細胞無顯著影響。第三部分野薔薇苷對抗過載力誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡及機制目的:通過研究過載力作用下細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,探討野薔薇苷對抗過載力刺激導(dǎo)致的細胞凋亡的作用及機制。方法:1實驗分組:本部分實驗在研究不同濃度野薔薇苷對過載力誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡模型的作用時,將生長狀況良好的細胞支架復(fù)合物分為6組,分別為:正常對照組(不加力),過載力加載模型組,野薔薇苷濃度為1×10-6mol/L組、1×10-8 mol/L組、1×10-10 mol/L組和1×10-12 mol/L組,均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h,持續(xù)8d;在研究野薔薇苷對抗過載力誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡機制時,將生長狀況良好的細胞支架復(fù)合物分為4組,分別為正常對照組,過載力加載模型組,維拉帕米(1×10-8 mol/L)組,野薔薇苷(1×10-8 mol/L)組,對照組不做力學(xué)加載,在同樣條件下培養(yǎng)8d,其余3組均在力學(xué)加載裝置中加載10000με每天2h,持續(xù)8d。2 Hoechst/PI熒光雙染法觀察野薔薇苷抗凋亡作用。3采用CCK-8方法測定OD值評價細胞增殖情況。4測定Caspase-3活性評價野薔薇苷抗凋亡基因活化情況。5測定LDH外漏量評價不同條件下細胞損傷情況。6測定細胞內(nèi)游離鈣離子濃度評價野薔薇苷抗凋亡機制。7 Realtime RT-PCR方法測定細胞內(nèi)Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2和Bax基因表達情況。8 Western Blot方法測定細胞內(nèi)Caspase-9,Caspase-3,Cyt-C,Bcl-2和Bax蛋白表達情況。結(jié)果:1熒光顯微鏡下可見,正常對照組細胞偶見紅染細胞;過載力加載模型組可見細胞核皺縮,細胞形狀不規(guī)整,出現(xiàn)凋亡小體并且可見大量紅染細胞;與模型組相比,各加藥組尤其是野薔薇苷1×10-8 mol/L和1×10-10mol/L組紅染細胞數(shù)量明顯減少。2與對照組相比,過載力加載模型組顯著降低(P0.05),與模型組相比,各濃度野薔薇苷均能顯著升高細胞活力(P0.05),其中1×10-10mol/L組最高。3各濃度野薔薇苷組LDH值均顯著低于模型組(P0.05)。4與對照組相比,過載力加載模型組Caspase-3活性顯著升高(P0.05);加入野薔薇苷可明顯降低Caspase-3活化程度(P0.05);其中1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L組Caspase-3活性低于1×10-6 mol/L和1×10-12 mol/L組。5與對照組相比,過載力加載模型組Caspase-3和Caspase-9 m RNA及其蛋白水平明顯升高(P0.05);加入野薔薇苷后Caspase-3和Caspase-9m RNA和蛋白水平明顯降低(P0.05)。6與對照組相比,過載力加載模型組細胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高(P0.05),維拉帕米和野薔薇苷均能阻止細胞內(nèi)鈣離子升高(P0.05)。7與對照組相比,過載力加載模型組Caspase-3,Caspase-9 m RNA表達水平以及Bax/Bcl-2的比值均顯著升高(P0.05);與模型組相比,維拉帕米組除Caspase-9外,其余均顯著性降低(P0.05);野薔薇苷組Caspase-3,Caspase-9 m RNA表達水平以及Bax/Bcl-2的比值與模型組均顯著性降低(P0.05)。8與對照組相比,過載力加載模型組細胞Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平顯著升高,Bcl-2顯著降低;與模型組相比,維拉帕米組和野薔薇苷組Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平顯著降低,Bcl-2蛋白水平顯著升高。結(jié)論:1過載力刺激對成骨細胞有“雙向刺激”作用,短期作用能刺激成骨細胞增殖分化,長期作用則導(dǎo)致成骨細胞凋亡。2短期過載力刺激促進細胞膜上鈣離子通道的開放和促進ATP向基質(zhì)分泌,共同促進細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高,長期過載力刺激僅作用于細胞膜上鈣離子通道的開放導(dǎo)致細胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載。3適當(dāng)濃度的野薔薇苷能有效降低細胞內(nèi)游離鈣離子濃度,下調(diào)細胞凋亡基因的表達,對抗長期過載力刺激導(dǎo)致的成骨細胞凋亡。
【圖文】：

圖 1 有限元分析不同表觀應(yīng)力下 PCL 材料應(yīng)力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.

圖 1 有限元分析不同表觀應(yīng)力下 PCL 材料應(yīng)力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2639411