發(fā)布時間：2020-04-24 05:24

【摘要】：中成藥為我國人民群眾常用藥品,其質量安全為中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的基礎。目前根據《中國藥典》規(guī)定,傳統(tǒng)中成藥的鑒別方式分為顯微觀察和化學檢測。中成藥品種類繁多,制作工藝復雜多樣,傳統(tǒng)的鑒定方法不能完全對藥品成分定性分析,因此不法商家借機在藥品中摻假造假,干擾市場秩序,危害消費者健康。本研究以三類中成藥為例,從分子診斷角度出發(fā),以DNA條形碼為基礎,通過DNA mini-barcode和meta-barcode對不同類型的中成藥成分進行多方面分析和對比,探索多種分子檢測方法,比較不同方法對中成藥檢測結果的利與弊,為建立適合中成藥的分子診斷方法學提供了參考。研究具體內容和方法如下:1.改良中成藥DNA提取方法,得到更高純度DNA;2.基于基原物種條形碼序列建立物種數據庫,MEGA比對和篩選特異性片段和穩(wěn)定遺傳的SNP位點。通過設計特異性引物對短片段進行PCR擴增,得到DNA mini-barcode。通過下游的瓊脂糖凝膠電泳,一代測序等方法對檢測結果進行驗證;3.結合一代分子克隆測序和二代高通量測序技術對多組分中成藥進行DNA meta-barcode分析,利用生物信息學對二代測序結果展開精確到單堿基匹配的結果分析。研究結果如下:1.共收集76份金銀花,山銀花以及杜仲植物樣品�；诙胖賳螌賳畏N特性在其ITS2序列開發(fā)出特異性的短序列分子身份證�；诮疸y花,山銀花ITS2序列,分析找到了具有穩(wěn)定遺傳的SNP位點,并設計特異性引物擴增帶有此SNP位點的DNA mini-barcode序列,通過SNP位點測序峰圖粗判金銀花/山銀花摻偽比例。此方法可以用于對多組分金銀花/山銀花中成藥中混偽品山銀花和杜仲兩種混偽品的單組分鑒定。對47份金銀花中成藥的鑒定結果表明,78%的藥品中摻雜杜仲或山銀花,證實DNA mini-barcode可以對金銀花類產品進行有效分子鑒定。2.通過分子克隆和二代測序對中成藥蛇膽川貝膠囊/散、川貝末膠囊中貝母成分進行鑒定。20份貝母中成藥進行了分子克隆實驗,并選取其中三份進行了二代測序,利用其高通量測序可獲得大量ITS2的meta-barcode序列。在20份川貝母中成藥中均檢測出伊犁貝母、平貝母等非標簽成分,僅2份含有川貝母。3.以人參健脾丸為例,結合二代測序和分子克隆對多植物組分中成藥進行成分鑒定。建立了人參健脾丸藥材飲片的對照模型,通過生物信息學對DNA meta-barcode數據進行精準深度分析。在人參健脾丸的陽性對照實驗的數據分析中,該分析方法可以成功鑒定11味組方中的9種成分,并成功過濾掉冗余序列,保證測序結果準確性。本研究基于DNA條形碼技術,從mini-barcode到meta-barcode對種類多樣的中成藥成分成功鑒定,提出了不同于傳統(tǒng)鑒定的短片段分子診斷方法,該方法進一步拓寬了 DNA條形碼在中成藥鑒定中的應用范圍,并使得鑒定結果更加精準。
【圖文】：

的ＩＴＳ２序列的基礎上開發(fā)出一段ＩＴＳ２序列中極具保守性的短序列（５邋１逡逑ＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴ３邋’），長度為邋３４ｂｐ。根據邋ＢＬＡＳＴ逡逑結果（圖２－１）可以看出序列覆蓋度ｑｕｅｒｙ和相似度ｉｄｅｎｔ均為１００％。證明該序列為杜逡逑仲所獨有，該序列在ＮＣＢＩ數據庫或者ＢＯＬＤ數據中均可以成功區(qū)分杜仲和其他物逡逑種，因此成為杜仲分子身份證。本研究在分子身份證的基礎上設計出可以擴增出該逡逑段序列的特異性引物ＤＺＦ１／Ｒ１，，擴增序列長度約為２１０邋ｂｐ。逡逑ｉｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ邐－邐＇邐：：：：：：邐＇邐一￣—＇＾逡逑Ｍａｘ邋Ｔｃｔｔｌ邋Ｑｕ？ｖ邋Ｅ邋＾邋ＡＫｅｓｓｉｃｎ邋：逡逑ｓｃｏｒｅ邋ｓｃｏｒｅ邋ｃｏｖｅｒ邋ｖａｌｕｅ逡逑ｒ＇邋＇■邋ｃｃＱｒ＇ＭＴｉｔ－邐＾邐６２邋６邋６２．６邋１００％邋７ｅ－０８邋１００％邋Ｋ￣６ｇ｜２Ｓ？Ｊ逡逑Ｃ．ｃｕｍｒｒ．0邐＾ｃ．－ｃ邋Ｒｉ－ｍ邋ｇｔ－＇．ｅ．邋＞ｉａ．Ｔ

ＩＴＳ２的擴增子長度為４２０邋ｂｐ。對金銀花和山銀花ＩＴＳ２序列進行分析后，可逡逑以在兩個物種間發(fā)現穩(wěn)定存在的２個ＳＮＰ位點。在金銀花中兩個位點對應的堿基逡逑分別為Ｇ和Ｃ，而４種山銀花中則為Ａ和Ｔ邋（圖２－３），ＳＮＰ位點所對應的位置分別逡逑在１６邋ｂｐ和６４邋ｂｐ。該ＳＮＰ位點分布穩(wěn)定，在數據庫中所有的金銀花和山銀花樣品逡逑中均得到了驗證。逡逑為了驗證ＳＮＰ雙峰法可以定量估計混合物中金銀花和山銀花所占比例，本實驗逡逑將金銀花和山銀花粉末按照不同比例進行混合，比例分別為金銀花－山銀花：逡逑１５：１，４：１，１：４，１：１５，共四種混合物。對該四種混合物提取ＤＮＡ，利用通用引物２Ｆ／３Ｒ逡逑３３逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284.1

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