【摘要】：中成藥為我國人民群眾常用藥品,其質(zhì)量安全為中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。目前根據(jù)《中國藥典》規(guī)定,傳統(tǒng)中成藥的鑒別方式分為顯微觀察和化學(xué)檢測。中成藥品種類繁多,制作工藝復(fù)雜多樣,傳統(tǒng)的鑒定方法不能完全對藥品成分定性分析,因此不法商家借機(jī)在藥品中摻假造假,干擾市場秩序,危害消費(fèi)者健康。本研究以三類中成藥為例,從分子診斷角度出發(fā),以DNA條形碼為基礎(chǔ),通過DNA mini-barcode和meta-barcode對不同類型的中成藥成分進(jìn)行多方面分析和對比,探索多種分子檢測方法,比較不同方法對中成藥檢測結(jié)果的利與弊,為建立適合中成藥的分子診斷方法學(xué)提供了參考。研究具體內(nèi)容和方法如下:1.改良中成藥DNA提取方法,得到更高純度DNA;2.基于基原物種條形碼序列建立物種數(shù)據(jù)庫,MEGA比對和篩選特異性片段和穩(wěn)定遺傳的SNP位點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)特異性引物對短片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到DNA mini-barcode。通過下游的瓊脂糖凝膠電泳,一代測序等方法對檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;3.結(jié)合一代分子克隆測序和二代高通量測序技術(shù)對多組分中成藥進(jìn)行DNA meta-barcode分析,利用生物信息學(xué)對二代測序結(jié)果展開精確到單堿基匹配的結(jié)果分析。研究結(jié)果如下:1.共收集76份金銀花,山銀花以及杜仲植物樣品。基于杜仲單屬單種特性在其ITS2序列開發(fā)出特異性的短序列分子身份證。基于金銀花,山銀花ITS2序列,分析找到了具有穩(wěn)定遺傳的SNP位點(diǎn),并設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增帶有此SNP位點(diǎn)的DNA mini-barcode序列,通過SNP位點(diǎn)測序峰圖粗判金銀花/山銀花摻偽比例。此方法可以用于對多組分金銀花/山銀花中成藥中混偽品山銀花和杜仲兩種混偽品的單組分鑒定。對47份金銀花中成藥的鑒定結(jié)果表明,78%的藥品中摻雜杜仲或山銀花,證實(shí)DNA mini-barcode可以對金銀花類產(chǎn)品進(jìn)行有效分子鑒定。2.通過分子克隆和二代測序?qū)χ谐伤幧吣懘ㄘ惸z囊/散、川貝末膠囊中貝母成分進(jìn)行鑒定。20份貝母中成藥進(jìn)行了分子克隆實(shí)驗(yàn),并選取其中三份進(jìn)行了二代測序,利用其高通量測序可獲得大量ITS2的meta-barcode序列。在20份川貝母中成藥中均檢測出伊犁貝母、平貝母等非標(biāo)簽成分,僅2份含有川貝母。3.以人參健脾丸為例,結(jié)合二代測序和分子克隆對多植物組分中成藥進(jìn)行成分鑒定。建立了人參健脾丸藥材飲片的對照模型,通過生物信息學(xué)對DNA meta-barcode數(shù)據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)深度分析。在人參健脾丸的陽性對照實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析中,該分析方法可以成功鑒定11味組方中的9種成分,并成功過濾掉冗余序列,保證測序結(jié)果準(zhǔn)確性。本研究基于DNA條形碼技術(shù),從mini-barcode到meta-barcode對種類多樣的中成藥成分成功鑒定,提出了不同于傳統(tǒng)鑒定的短片段分子診斷方法,該方法進(jìn)一步拓寬了 DNA條形碼在中成藥鑒定中的應(yīng)用范圍,并使得鑒定結(jié)果更加精準(zhǔn)。
【圖文】：

的ＩＴＳ２序列的基礎(chǔ)上開發(fā)出一段ＩＴＳ２序列中極具保守性的短序列（５邋１逡逑ＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴ３邋’），長度為邋３４ｂｐ。根據(jù)邋ＢＬＡＳＴ逡逑結(jié)果（圖２－１）可以看出序列覆蓋度ｑｕｅｒｙ和相似度ｉｄｅｎｔ均為１００％。證明該序列為杜逡逑仲所獨(dú)有，該序列在ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫或者ＢＯＬＤ數(shù)據(jù)中均可以成功區(qū)分杜仲和其他物逡逑種，因此成為杜仲分子身份證。本研究在分子身份證的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出可以擴(kuò)增出該逡逑段序列的特異性引物ＤＺＦ１／Ｒ１，，擴(kuò)增序列長度約為２１０邋ｂｐ。逡逑ｉｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ邐－邐＇邐：：：：：：邐＇邐一￣—＇＾逡逑Ｍａｘ邋Ｔｃｔｔｌ邋Ｑｕ？ｖ邋Ｅ邋＾邋ＡＫｅｓｓｉｃｎ邋：逡逑ｓｃｏｒｅ邋ｓｃｏｒｅ邋ｃｏｖｅｒ邋ｖａｌｕｅ逡逑ｒ＇邋＇■邋ｃｃＱｒ＇ＭＴｉｔ－邐＾邐６２邋６邋６２．６邋１００％邋７ｅ－０８邋１００％邋Ｋ￣６ｇ｜２Ｓ？Ｊ逡逑Ｃ．ｃｕｍｒｒ．0邐＾ｃ．－ｃ邋Ｒｉ－ｍ邋ｇｔ－＇．ｅ．邋＞ｉａ．Ｔ

ＩＴＳ２的擴(kuò)增子長度為４２０邋ｂｐ。對金銀花和山銀花ＩＴＳ２序列進(jìn)行分析后，可逡逑以在兩個物種間發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在的２個ＳＮＰ位點(diǎn)。在金銀花中兩個位點(diǎn)對應(yīng)的堿基逡逑分別為Ｇ和Ｃ，而４種山銀花中則為Ａ和Ｔ邋（圖２－３），ＳＮＰ位點(diǎn)所對應(yīng)的位置分別逡逑在１６邋ｂｐ和６４邋ｂｐ。該ＳＮＰ位點(diǎn)分布穩(wěn)定，在數(shù)據(jù)庫中所有的金銀花和山銀花樣品逡逑中均得到了驗(yàn)證。逡逑為了驗(yàn)證ＳＮＰ雙峰法可以定量估計(jì)混合物中金銀花和山銀花所占比例，本實(shí)驗(yàn)逡逑將金銀花和山銀花粉末按照不同比例進(jìn)行混合，比例分別為金銀花－山銀花：逡逑１５：１，４：１，１：４，１：１５，共四種混合物。對該四種混合物提�。模危粒猛ㄓ靡铮玻疲常义义希常冲义�
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284.1

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本文編號：2638576