【摘要】：目的:分別從體內(nèi)和體外兩個方面來考察半枝蓮的主要成分野黃芩苷對結(jié)腸腫瘤干細胞(CSC)分化的影響,從Hedgehog信號通路闡明其作用機制,為野黃芩苷抗腫瘤作用的研究提供科學(xué)的實驗基礎(chǔ)。方法:(1)采用磁珠抗體標記法從HT-29人結(jié)腸腺癌上皮細胞中分選出結(jié)腸腫瘤干細胞(HT-29CSC),并對其進行無血清懸浮培養(yǎng);(2)CCK-8法研究野黃芩苷對HT-29CSC體外活性的影響;(3)干細胞球形成法研究野黃芩苷對HT-29CSC體外自我更新的影響;(4)3D培養(yǎng)法研究野黃芩苷對HT-29CSC體外生長狀態(tài)的影響;(5)軟瓊脂克隆法研究野黃芩苷對HT-29CSC體外生長轉(zhuǎn)化的影響;(6)血清誘導(dǎo)分化試驗研究野黃芩苷對HT-29CSC體外分化的影響;(7)q RT-PCR法研究野黃芩苷對Hedgehog信號通路基因Gli1、Ptch1,HT-29CSC標記物基因CD133、Lgr5,靶基因c-Myc、增殖基因Ki67、分化基因CK20和更新基因Nanog表達的影響;(8)Western Blot法研究野黃芩苷對HT-29CSC中c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白表達的影響;(9)建立結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型,采用腹腔注射方式進行給藥,觀察記錄裸鼠體重和移植瘤的體積大小的變化,研究野黃芩苷對結(jié)腸癌HT-29CSC裸鼠移植瘤生長的影響;(10)q RT-PCR檢測裸鼠移植瘤CD133、Lgr5、Gli1、Ptch1、c-Myc、Ki67、CK20、Nanog基因的表達;(11)Western Blot法檢測裸鼠移植瘤c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白的表達;(12)IHC法檢測裸鼠移植瘤CD133、c-Myc、Ki67、Gli1蛋白的表達。結(jié)果:(1)流式結(jié)果顯示,經(jīng)磁珠分選后HT-29CSC中CD133的陽性表達率可高達99%;(2)野黃芩苷能夠抑制HT-29CSC的體外活性,濃度越大,抑制作用越強。(3)野黃芩苷能夠抑制HT-29CSC的體外成球能力,其中80μg/ml野黃芩苷、160μg/ml野黃芩苷成球率分別為(5.02±0.39)%、(1.53±0.35)%,顯著低于溶劑對照組的成球率(12.20±0.32)%(P0.01);(4)野黃芩苷能夠抑制3D培養(yǎng)HT-29CSC的生長,濃度越大,生長形態(tài)越差;(5)與溶劑對照組比較,野黃芩苷可以顯著抑制HT-29CSC的體外生長轉(zhuǎn)化(P0.01);(6)野黃芩苷能夠抑制HT-29CSC的體外分化能力,濃度越大,分化能力越弱;(7)野黃芩苷能夠下調(diào)HT-29CSC中Hedgehog信號通路基因Gli1、Ptch1,標記物基因CD133、Lgr5,靶基因c-Myc,增殖基因Ki67,分化基因CK20和更新基因Nanog的表達水平;(8)野黃芩苷能夠降低HT-29CSC中c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白的表達;(9)野黃芩苷對結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長具有抑制趨向;(10)野黃芩苷能夠下調(diào)裸鼠移植瘤中CD133、Lgr5、Gli1、Ptch1、c-Myc、Ki67、CK20、Nanog基因的表達;(11)野黃芩苷能夠降低裸鼠移植瘤中c-Myc、Gli1、Lgr5、CD133、Ki67蛋白的表達。結(jié)論:半枝蓮的主要成分野黃芩苷能夠抑制HT-29CSC分化,其作用機制在于抑制Hedgehog信號通路的活性。
【圖文】：

芩苷抑制人結(jié)腸腫瘤干細胞體腸癌上皮細胞株 HT-29，人小腸上皮細芩苷（C21H18O12），分子量 462.36，，分司，進口分析純，批號：73577。Hedg購自 Sigma-Aldrich 公司，批號：G9048裝凍存于-20℃，臨用前用細胞培養(yǎng)液稀

（二）磁珠分選、流式細胞儀檢測①制備 MS 柱：將 MS 柱置于 MiniMACS 手動分選器中，小心向柱內(nèi)uffer 進行潤柱。注意加入 Buffer 時不能產(chǎn)生氣泡否則會堵塞柱子。②上柱：待 MS 柱中的 Buffer 不再往下滴落時，將之前制備的 500至柱中，讓其自然從柱中滴落。③洗柱：待加入的細胞懸液停止往下滴落后，小心加入 500μl Buff從柱中流出，待柱中不再有 Buffer 流出時，重新加入 500μl 的 Buffe過程需要重復(fù)操作三遍。④ 沖柱：待洗柱過程結(jié)束后，小心將 MS 柱移出分選器，然后放置集管中，加入 1ml Buffer 于 MS 柱中，再用配套的柱塞快速將液體⑤ 收集被推出的液體，上機檢測。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)免疫磁珠分選后得到的 HT-29CSC 中 達率可高達 99.0%，說明分選出的 HT-29CSC 純度較好。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2638408