發(fā)布時(shí)間：2020-04-22 13:55

【摘要】：目的:文冠果皂苷E(皂苷E)是一種豐富地存在于文冠果果殼和果柄中的具有顯著生物活性的玉蕊醇型三萜皂苷,經(jīng)過其他學(xué)者和課題組前期的研究,發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。為了提高其溶解度,本研究對皂苷E進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造,將其制備成鈉鹽。利用4T1乳腺癌小鼠模型對皂苷E的鈉鹽進(jìn)行抗腫瘤活性的體內(nèi)藥效學(xué)驗(yàn)證,同時(shí)為了證明其對人乳腺癌的功效,引入MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究對象。在藥物安全性方面對皂苷E的急性毒性實(shí)驗(yàn)及溶血性進(jìn)行了初步的評價(jià)和探討,旨在為后續(xù)皂苷E的成藥研究提供借鑒與參考。方法:將皂苷E與等摩爾量的NaOH進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)得到皂苷E的鈉鹽。然后分別測定皂苷E及其鈉鹽抗4T1乳腺癌細(xì)胞系的IC_(50)值。通過比較驗(yàn)證皂苷E鈉鹽的抗腫瘤活性。利用4T1乳腺癌細(xì)胞和Balb/c小鼠構(gòu)建4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型,將其隨機(jī)分配為模型組(生理鹽水),陽性藥組即鹽酸阿霉素組(5mg·kg~(-1)),低劑量皂苷E鈉鹽組(0.5mg·kg~(-1))及高劑量皂苷E鈉鹽組(1.0mg·kg~(-1)),各組每間隔2天給一次藥,持續(xù)給藥5次,最后一次給藥后24小時(shí),將各組小鼠頸椎脫臼處死,取出小鼠的皮下腫瘤組織,進(jìn)行瘤體稱重,計(jì)算小鼠腫瘤抑制率及腫瘤體積。通過對4T1荷瘤小鼠腫瘤腫塊的重量和體積的比較評價(jià)皂苷E鈉鹽的腫瘤抑制活性。繼續(xù)引入MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究對象,利用CCK-8法測定細(xì)胞毒性,Western blot檢測不同濃度皂苷E鈉鹽對MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響。毒性試驗(yàn)選用階梯法和Bliss法來測定半數(shù)致死量(LD_(50))。階梯法選用SPF級健康雌性昆明種小鼠13只,以1 mg·kg~(-1)為起始劑量,相鄰劑量比為1:0.7,給藥方式為尾靜脈注射,遵循《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行試驗(yàn)。Bliss法選用SPF級健康雌性昆明種小鼠42只,隨機(jī)分為7組,每組6只,設(shè)定6個(gè)劑量組(4.08、5.83、8.33、11.90、17.00、24.28 mg·kg~(-1))和空白對照組,給藥方式為尾靜脈注射,給藥一次后,連續(xù)觀察14天,記錄各組小鼠的存活情況,運(yùn)用Bliss法計(jì)算LD_(50),檢測存活小鼠的生理生化指標(biāo),對小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟等主要臟器進(jìn)行病理切片觀察。溶血實(shí)驗(yàn)取SPF級健康雌性家兔,經(jīng)動(dòng)脈插管取血并制備2%血細(xì)胞懸浮液,設(shè)定10個(gè)劑量組(0.16、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00μg·ml~(-1)),按照2015版《中華人民共和國藥典》“溶血與凝聚檢查法”指導(dǎo)通則進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:經(jīng)過紅外光譜的鑒定,皂苷E鈉鹽結(jié)構(gòu)改造的位點(diǎn)為葡萄糖醛酸的羧基上的活潑氫,并沒有使其官能團(tuán)發(fā)生改動(dòng)。通過皂苷E與其鈉鹽對4T1乳腺癌細(xì)胞的IC_(50)值進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)二者對4T1乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性無顯著性差異。皂苷E鈉鹽對4T1乳腺癌小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:無論是從重量上還是從體積上,給藥組明顯低于對照組,且表現(xiàn)出了與陽性藥阿霉素相近的抑制作用,但是對于小鼠體重的影響較阿霉素小。MCF-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,皂苷E鈉鹽IC_(50)值為5.33μM,隨著濃度的增大,MCF-7增殖減弱,細(xì)胞抑制率明顯升高(P0.05),且呈現(xiàn)出劑量依賴性。采用Western blot技術(shù)檢測凋亡因子的表達(dá),結(jié)果顯示與空白對照組相比,隨著給藥濃度的增加,MCF-7細(xì)胞促凋亡蛋白BAD的表達(dá)水平降低(P0.05),而促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)水平升高(P0.05)。同時(shí)促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的比值呈現(xiàn)上升趨勢。急性毒性研究結(jié)果顯示:皂苷E鈉鹽靜脈注射的LD_(50)值為8.35 mg·kg~(-1),組織切片和生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明,皂苷E鈉鹽能誘導(dǎo)肝竇充血與腎小管上皮細(xì)胞變性;能夠誘導(dǎo)GOT和Cr異常升高。皂苷E鈉鹽在0.63μg·ml~(-1)的濃度表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶血性,其安全劑量應(yīng)為0.31μg·ml~(-1)以下。結(jié)論:鈉鹽的改造在解決皂苷E水溶性比較差的問題的同時(shí)對其抑制腫瘤細(xì)胞的活性并沒有明顯影響。將皂苷E改造成鈉鹽能夠顯著提高其水溶性,使其能夠作為注射劑給藥,結(jié)果表明鈉鹽的細(xì)胞毒活性并沒有降低。所以我們初步認(rèn)為在研究皂苷E的抗腫瘤活性及其機(jī)制研究的過程中,皂苷E的鈉鹽可以代替皂苷E進(jìn)行活性研究。通過進(jìn)行體內(nèi)外的藥效學(xué)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)皂苷E鈉鹽具有明顯的抗乳腺癌活性。同時(shí)皂苷E鈉鹽的安全閾值較低,溶血活性極強(qiáng),體內(nèi)毒性主要表現(xiàn)為肝毒性與腎毒性。溶血活性與其毒性有一定聯(lián)系,在新藥研發(fā)上,還需要對其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)加以改變,以提高其安全性。以上實(shí)驗(yàn)為后續(xù)皂苷E的成藥研究提供了借鑒與參考。
【圖文】：

圖 1.1C 文冠果皂苷 E 結(jié)構(gòu)改造果皂苷 E 與其鈉鹽的活性對比察改造前后化合物與目標(biāo)產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性是否存有差外細(xì)胞毒活性的對比研究。通過皂苷 E 與其鈉鹽對 4T1 腫瘤細(xì)胞（見圖 1.2），得出皂苷 E 的 IC50值為 44.24μM，其鈉鹽的 I發(fā)現(xiàn)二者活性無顯著差異。皂苷 E皂苷 E 鈉鹽

圖 1.1C 文冠果皂苷 E 結(jié)構(gòu)改造3.2 文冠果皂苷 E 與其鈉鹽的活性對比為了考察改造前后化合物與目標(biāo)產(chǎn)物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性是否存有差異，我們進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性的對比研究。通過皂苷 E 與其鈉鹽對 4T1 腫瘤細(xì)胞的 IC50值進(jìn)行比較（見圖 1.2），，得出皂苷 E 的 IC50值為 44.24μM，其鈉鹽的 IC50值為40.13μM，發(fā)現(xiàn)二者活性無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2636590