【摘要】：目的:研究薯蕷皂苷(Dioscin)對(duì)大鼠髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用;并探討藥物作用的可能機(jī)制。方法:提取SD大鼠原代髓核細(xì)胞培養(yǎng)至第二代用于實(shí)驗(yàn)研究。構(gòu)建體外髓核細(xì)胞過(guò)氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型。使用不同濃度的Dioscin和過(guò)氧化氫干預(yù)髓核細(xì)胞,通過(guò)CCK8細(xì)胞活性檢測(cè),確定Dioscin最佳實(shí)驗(yàn)濃度并分組實(shí)驗(yàn)。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡情況;檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性;檢測(cè)丙二醛(MDA)含量;DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量;免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)分布;免疫印跡(Western Blot)分析髓核細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白(Caspase3、Caspase9和Bax)、炎癥介質(zhì)(INOS、COX2、IL-6)、金屬蛋白酶(MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5)、基質(zhì)合成代謝因子(Collagen2及SOX9)、通路蛋白(NOX4、p-p65/p65、p-JNK/JNK)的表達(dá)情況。結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)200u M的過(guò)氧化氫可以使髓核細(xì)胞的活性降低51%,被用于構(gòu)建體外大鼠髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。濃度范圍低于600n M的Dioscin對(duì)大鼠髓核細(xì)胞無(wú)明顯毒性,同時(shí)200n M的Dioscin可以明顯改善過(guò)氧化氫導(dǎo)致的大鼠髓核細(xì)胞活性下降。Dioscin可以下調(diào)凋亡蛋白Caspase3、Caspase9和Bax的表達(dá)水平,抑制H_20_2誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞的線粒體凋亡。Dioscin通過(guò)減少ROS和MDA的生成、增強(qiáng)SOD的活性恢復(fù)大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。Dioscin抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)INOS、COX2、IL-6的水平升高,減輕大鼠髓核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)損傷。Diosicn可以阻斷過(guò)氧化氫刺激引起的ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13等基質(zhì)金屬蛋白酶的過(guò)表達(dá),同時(shí)上調(diào)包括Collagen2、SOX9在內(nèi)的合成因子的蛋白水平。過(guò)氧化氫可以誘導(dǎo)NOX4的高表達(dá),而Dioscin通過(guò)下調(diào)NOX4表達(dá)水平,降低NF-κB和JNK通路蛋白的磷酸化,從而抑制NF-κB和JNK通路的激活。結(jié)論:本研究表明,髓核細(xì)胞在氧化應(yīng)激下可以通過(guò)激活Nox4/NF-κB/JNK通路促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放,上調(diào)椎間盤基質(zhì)分解代謝因子并導(dǎo)致基質(zhì)分解過(guò)度,最終加速椎間盤的退變。Dioscin可以抑制ROS生成,重建髓核細(xì)胞內(nèi)的氧化與抗氧化平衡,改善髓核細(xì)胞內(nèi)的炎性環(huán)境,保護(hù)髓核細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷。因此,Dioscin在椎間盤退變中具有潛在的治療前景。
【圖文】：

17圖 1：Dioscin 及 H2O2對(duì)大鼠髓核細(xì)胞活性的影響。（A）不同濃度的 H2O2（0、100uM、200uM、300uM、400uM）對(duì)大鼠髓核細(xì)胞活性的影響；（B）不同濃度的 Dioscin（0、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM）對(duì)大鼠髓核細(xì)胞的毒性；（C）不同濃度的 Dioscin 對(duì) H2O2干預(yù)下大鼠髓核細(xì)胞活性的保護(hù)作用。##，，p ＜ 0.01（vs 對(duì)照組）；**，p ＜ 0.01（Dioscin 組 vs H2O2組）

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文圖 3：Dioscin 對(duì)大鼠髓核細(xì)胞內(nèi) ROS、MDA 及 SOD 表達(dá)水平的影響不同干預(yù)條件下大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的流式檢測(cè)；（B）大鼠胞內(nèi) ROS 表達(dá)水平的定量分析；（C）ROS 在大鼠髓核內(nèi)分布情況的免檢測(cè)；（D）大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)；（F）核細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）的表達(dá)情況。## 表示 p ＜ 0.01（相比于對(duì)照** 表示 p ＜ 0.01（Dioscin 組與 H2O2組比較）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2634465