【摘要】：背景與目的:脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能障礙、缺失,重者會(huì)導(dǎo)致癱瘓殘疾或者死亡。主要的致病因素是患者脊柱受到外界暴力的打擊,而造成脊髓的損傷。隨著對(duì)脊髓損傷的治療的研究不斷加深,越來越多的方法能夠緩解脊髓損傷帶來的傷害,在一定程度上減輕脊髓損傷患者的臨床癥狀,但是目前治療的方法都存在有一定的缺陷,如有不良反應(yīng)產(chǎn)生、療效不明確、價(jià)格高昂、患者依從性差等,能夠完全治愈脊髓損傷的理想治療方法還未找到。山楂葉總黃酮(Total flavonoids from hawthorn leaves,TFHL)是一種具有生物活性的植物化學(xué)物,它的主要成分為黃酮類化合物,有研究表明該物質(zhì)具有降壓、降脂、抗炎、抗氧化等作用,在對(duì)于治療脊髓損傷的方向還未有研究。本課題組就山楂葉總黃酮對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)功能展開研究,在改良的Allen法建造的大鼠脊髓損傷模型上,檢測(cè)山楂葉總黃酮能否對(duì)脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用,對(duì)損傷后的炎性因子分泌是否具有抑制作用,對(duì)損傷后的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是否有促進(jìn)作用,探討山楂葉總黃酮對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制,并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。方法:1、利用改良的ALLEN打擊法構(gòu)建大鼠脊髓損傷的動(dòng)物模型,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分為五個(gè)組:假手術(shù)組(SHAM組)、損傷組(SCI組)、山楂葉總黃酮治療組:低劑量組12.5mg/kg、中劑量組25mg/kg、高劑量組50mg/kg。2、使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分方法在SCI后1d、3d、5d、7d幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓損傷段以下的神經(jīng)肢體運(yùn)動(dòng)的觀察,分析大鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)的變化。3、采用HE染色方法對(duì)脊髓組織進(jìn)行染色,觀察脊髓損傷后脊髓組織的病理變化情況與山楂葉總黃酮對(duì)損傷脊髓的組織修復(fù)情況。采用掃描電鏡觀察脊髓神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞器的變化情況,觀察山楂葉總黃酮對(duì)細(xì)胞器變化的影響。4、采用尼氏染色法對(duì)大鼠的脊髓組織進(jìn)行染色,觀察神經(jīng)元細(xì)胞的病理變化情況,計(jì)算脊髓組織中神經(jīng)元與尼氏小體的數(shù)量,分析山楂葉總黃酮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)作用。5、采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α相關(guān)基因的表達(dá),分析炎性因子在脊髓組織中的變化情況。6、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組脊髓組織中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)相關(guān)基因表達(dá),Western Blot檢測(cè)各組脊髓組織GDNF、NGF、CNTF、BDNF蛋白的表達(dá)。分析山楂葉總黃酮對(duì)脊髓組織中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變化的影響。結(jié)果:1、BBB評(píng)分檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能情況:在脊髓損傷后的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi),其中假手術(shù)組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能正常,分值為穩(wěn)定最高值;損傷組分值明顯降低(P0.01),隨時(shí)間的增加而升高,隨藥物劑量濃度的改變有不同程度的升高,當(dāng)藥物濃度為25mg/kg時(shí),評(píng)分?jǐn)?shù)值達(dá)到最高峰值(P0.05)。2、術(shù)后72小時(shí),HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞核完整,大小正常,排列整齊,無出血點(diǎn);損傷組出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn),有出血點(diǎn),出現(xiàn)大量空洞,細(xì)胞核形態(tài)改變;治療組較損傷組細(xì)胞形態(tài)都有所好轉(zhuǎn),空洞數(shù)量減少,出血點(diǎn)減少,在山楂葉總黃酮濃度為25mg/kg時(shí),效果最明顯,其空洞率較損傷組明顯減小(P0.05)。3、掃描電鏡結(jié)果顯示,假手術(shù)組中髓鞘外形有規(guī)則,排列整齊緊湊,結(jié)構(gòu)完整,線粒體飽滿;損傷組髓鞘外形不規(guī)則,排列混亂,板層結(jié)構(gòu)排列松散,線粒體腫脹;山楂葉總黃酮干預(yù)組病理現(xiàn)象均有好轉(zhuǎn),髓鞘外形較為規(guī)則有序,板層結(jié)構(gòu)較為緊湊,線粒體腫脹減輕。在山楂葉總黃酮濃度為25mg/kg時(shí),程度較損傷組有明顯的改善,病理變化最少。4、ELISA檢測(cè)炎性因子的IL-1β、IL-6和TNF-α含量變化的結(jié)果顯示,SCI組較SHAM組明顯增高(P0.01)隨著治療組給藥濃度的逐步增高,各組中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均下降,當(dāng)藥物濃度達(dá)到25mg/kg時(shí),各組中的因子降到最低值(P0.05)。5、RT-PCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)結(jié)果顯示,損傷組較假手術(shù)組的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P0.05);與損傷組相比,治療組中相對(duì)表達(dá)量有所降低,當(dāng)山楂葉總黃酮濃度為25mg/kg時(shí),差異最顯著(P0.05)。6、尼氏染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)大小正常,可見斑塊樣尼氏體;損傷組神經(jīng)元形態(tài)固縮壞死,尼氏小體數(shù)量減少;給藥組隨山楂葉總黃酮濃度的升高,神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)越好,當(dāng)劑量濃度為25mg/kg時(shí),病理癥狀最輕,且尼氏小體與神經(jīng)元數(shù)量都有所增加(P0.05)。7、RT-PCR檢測(cè)GDNF、NGF、CNTF、BDNF mRNA表達(dá)的結(jié)果為,與假手術(shù)組相比,損傷組大鼠脊髓中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF的相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量有所增加;與損傷組相比,治療組中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量增加,當(dāng)山楂葉總黃酮濃度為25mg/kg時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8、Western blot檢測(cè)GDNF、NGF、CNTF、BDNF的蛋白表達(dá)結(jié)果為,損傷組中的各個(gè)營(yíng)養(yǎng)因子較假手術(shù)組都有一定增加,山楂葉總黃酮組中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF蛋白的表達(dá)量都增高,當(dāng)山楂葉總黃酮?jiǎng)┝繚舛葹?5mg/kg時(shí),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白表達(dá)量最高(P0.05)。結(jié)論:1、山楂葉總黃酮能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。2、山楂葉總黃酮能夠減輕大鼠脊髓損傷后的脊髓組織病理變化情況,如出血、水腫、空洞等,同時(shí)減輕神經(jīng)細(xì)胞的病理變化,說明山楂葉總黃酮能夠促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù),對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。3、山楂葉總黃酮能夠降低脊髓損傷中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),說明山楂葉總黃酮能夠調(diào)控脊髓組織中炎性因子的釋放,對(duì)炎癥反應(yīng)具有抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)脊髓組織的修復(fù),達(dá)到保護(hù)脊髓組織的作用。4、山楂葉總黃酮能夠促進(jìn)脊髓組織中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá),說明山楂葉總黃酮促進(jìn)了脊髓神經(jīng)組織的修復(fù)功能,對(duì)神經(jīng)組織起到保護(hù)作用。
【圖文】：

酮干預(yù)對(duì) BBB 評(píng)分的影響。A.各組 SD 大鼠 BBB 評(píng)分隨時(shí)間增加而升高 小時(shí)后各組 SD 大鼠 BBB 評(píng)分的比較（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）。of TFHL intervention on BBB score.A. TheBBB scores of SD rats in each groe of time. B. Comparison of BBB scores of SD rats in each group after 72 hocord injury（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）.組織 HE 染色織固定好切片后進(jìn)行蘇木精伊紅染色，于倒置顯微鏡組織形態(tài)特征（圖 2）。假手術(shù)組（SHAM）無損傷，常，細(xì)胞核大小正常，排列整齊，未見出血點(diǎn)；損傷組襲，有出血點(diǎn)產(chǎn)生，出現(xiàn)大量空洞，細(xì)胞核形態(tài)改變

傷組明顯減�。≒<0.05）。這些現(xiàn)象表明山楂葉總黃酮能夠減少炎癥反應(yīng)對(duì)脊髓的影響。圖2 各組大鼠脊髓組織HE染色，倒置顯微鏡（×40）下觀察，，并用Image J軟件計(jì)算其空洞率。（*P<0.05，**P<0.01）Figure 2. HE staining of spinal cord tissue of each group was observed under an inverted microscope (×40),and the cavitation rate was calculated by Image J software. （*P<0.05，**P<0.01）3.3掃描電鏡觀察脊髓組織細(xì)胞器形態(tài)將組織固定好后制作超薄切片，使用電鏡掃描（×20000），觀察細(xì)胞內(nèi)的變化情況（圖3）。假手術(shù)組中髓鞘外形有規(guī)則，排列整齊緊湊，結(jié)構(gòu)完整
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2632634