【摘要】：目的:1、觀察山茱萸環(huán)烯醚萜苷(Cornel Iridoid Glycoside,CIG)對(duì)糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性和蛋白表達(dá)的影響,及其對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究。2、明確CIG增強(qiáng)蛋白磷酸酶2A活性抑制tau蛋白過(guò)度磷酸化的作用機(jī)制。方法:(1)第一部分:CIG對(duì)WT/GFX擬AD模型大鼠的影響,(1)將Wistar大鼠隨機(jī)分為六組:假手術(shù)組、假手術(shù)組+CIG(60 mg/kg)、WT/GFX模型組、CIG小劑量組(60mg/kg)、CIG大劑量組(120 mg/kg)、陽(yáng)性藥物組(美金剛3 mg/kg)。(2)模型制備及給藥:Wistar大鼠灌胃給予CIG7天,同時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力,第7天記錄逃避潛伏期;第8天大鼠立體定位單側(cè)側(cè)腦室注射WT/GFX各200 u M,制備tau蛋白過(guò)度磷酸化擬AD模型;第9天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),記錄逃避潛伏期后處死,取腦組織。采用免疫熒光方法觀察腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化,應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)皮層和海馬PI3K/AKT信號(hào)通路以及突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。(2)第二部分:CIG對(duì)GSK-3β轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞的影響,小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(Neuro-2A cell,N2a細(xì)胞)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入野生型GSK-3β(Wt GSK-3β)質(zhì)粒,建立tau蛋白過(guò)度磷酸化模型,實(shí)驗(yàn)分為空白組、空白組+CIG(200μg/m L)、Wt GSK-3β、Wt GSK-3β+CIG(50μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(100μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(200μg/m L)。應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)tau蛋白在多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平,GSK-3β、p-GSK-3β-ser9以及細(xì)胞自噬通路中多個(gè)蛋白的表達(dá)水平。(3)第三部分:CIG對(duì)Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞的影響,(1)確定Src質(zhì)粒最佳轉(zhuǎn)染條件:將Src質(zhì)粒DNA(0.2,0.4,0.6,0.8μg)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞,觀察不同量Src對(duì)PP2A催化亞基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影響。(2)將0.6μg Src質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞,24h后加入CIG(50,100,200μg/m L)共同孵育24h,觀察CIG對(duì)Src,PTP1B,p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。結(jié)果:(1)第一部分:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:模型組與假手術(shù)組相比,逃避潛伏期明顯增加,CIG灌胃給藥使模型組大鼠逃避潛伏期明顯降低;免疫熒光實(shí)驗(yàn):模型組神經(jīng)元樹(shù)突數(shù)量減少,明顯斷裂,且排列雜亂,給予CIG后,樹(shù)突斷裂顯著減少,排列逐漸恢復(fù)整齊;Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示:模型組與假手術(shù)組相比,tau蛋白在Thr217及PHF-1(識(shí)別Ser396/404位點(diǎn))位點(diǎn)的磷酸化水平明顯增加,CIG使這些位點(diǎn)的磷酸化顯著降低;模型組皮層和海馬中p-GSK-3β-ser9表達(dá)降低,即GSK-3β激活,CIG灌胃給藥通過(guò)增加p-GSK-3β-ser9表達(dá),抑制GSK-3β活性;模型組PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路活性被抑制,p-IGF-I R、p-PI3K、PI3K-110α、p-PDK1、p-AKT表達(dá)量均減少,即IGF-I R、PI3K、PDK1、AKT活性被抑制,同時(shí)模型組p-IRS1增加,IRS1活性被抑制,CIG灌胃給藥使IGF-I R、PI3K、IRS1、PDK1、AKT活性明顯增加,進(jìn)而抑制GSK-3β活性;模型組中突觸相關(guān)蛋白p-synapsin、Synaptophysin、PSD95表達(dá)量明顯減少,CIG能升高p-synapsin、Synaptophysin、PSD95蛋白表達(dá)。(2)第二部分:N2a細(xì)胞過(guò)表達(dá)GSK-3β蛋白,p-GSK-3β-ser9、GSK-3β表達(dá)增加,tau蛋白在199/202、PHF-1位點(diǎn)磷酸化表達(dá)明顯增加;給予CIG處理后,p-GSK-3β-ser9明顯增加,即GSK-3β活性被抑制,GSK-3β總蛋白表達(dá)降低,tau蛋白在199/202、PHF-1位點(diǎn)磷酸化水平顯著降低。N2a細(xì)胞過(guò)表達(dá)GSK-3β后,給予CIG50、100、200μg/m L三個(gè)劑量,Beclin1、LC3Ⅱ、ATG12蛋白表達(dá)水平升高,即細(xì)胞自噬水平提高。(3)第三部分:(1)轉(zhuǎn)染Src(0.2,0.4,0.6μg)質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞,Src蛋白表達(dá)明顯增加,p-PP2Ac水平上調(diào),PP2Ac蛋白總量表達(dá)無(wú)變化,tau蛋白在Ser199/202、Ser396位點(diǎn)磷酸化顯著增加;轉(zhuǎn)染0.8μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞與轉(zhuǎn)染0.6μg Src相比,p-PP2Ac表達(dá)下降,PP2Ac蛋白總量表達(dá)無(wú)變化,tau蛋白在Ser199/202、Ser396位點(diǎn)磷酸化降低。(2)轉(zhuǎn)染0.6μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞,Src蛋白表達(dá)增加,p-PP2Ac表達(dá)增加,tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Thr217以及Ser396位點(diǎn)的磷酸化水平明顯增加;CIG對(duì)Src蛋白表達(dá)無(wú)影響,能夠抑制p-PP2Ac的表達(dá),抑制tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Thr217以及Ser396位點(diǎn)的磷酸化。此外,CIG能上調(diào)PTP1B蛋白表達(dá)。結(jié)論:1 CIG能通過(guò)減少tau蛋白過(guò)度磷酸化,保護(hù)神經(jīng)元形態(tài),增加突觸功能,進(jìn)而改善AD的學(xué)習(xí)記憶障礙;2 CIG能通過(guò)激活細(xì)胞自噬,降解GSK-3β蛋白;3 CIG能通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路,抑制GSK-3β活性;4 CIG能通過(guò)增加PTP1B的表達(dá),降低PP2A催化亞基C磷酸化,從而升高PP2A活性,進(jìn)一步降低tau蛋白的過(guò)度磷酸化水平;5 CIG對(duì)Src蛋白無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號(hào)：2632088