【摘要】：目的:1、觀察山茱萸環(huán)烯醚萜苷(Cornel Iridoid Glycoside,CIG)對糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)活性和蛋白表達的影響,及其對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)神經(jīng)保護作用機制的研究。2、明確CIG增強蛋白磷酸酶2A活性抑制tau蛋白過度磷酸化的作用機制。方法:(1)第一部分:CIG對WT/GFX擬AD模型大鼠的影響,(1)將Wistar大鼠隨機分為六組:假手術組、假手術組+CIG(60 mg/kg)、WT/GFX模型組、CIG小劑量組(60mg/kg)、CIG大劑量組(120 mg/kg)、陽性藥物組(美金剛3 mg/kg)。(2)模型制備及給藥:Wistar大鼠灌胃給予CIG7天,同時進行Morris水迷宮實驗檢測空間學習記憶能力,第7天記錄逃避潛伏期;第8天大鼠立體定位單側側腦室注射WT/GFX各200 u M,制備tau蛋白過度磷酸化擬AD模型;第9天進行水迷宮實驗,記錄逃避潛伏期后處死,取腦組織。采用免疫熒光方法觀察腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化,應用Western blotting方法檢測皮層和海馬PI3K/AKT信號通路以及突觸相關蛋白的表達水平。(2)第二部分:CIG對GSK-3β轉染N2a細胞的影響,小鼠神經(jīng)瘤母細胞(Neuro-2A cell,N2a細胞)中瞬時轉染入野生型GSK-3β(Wt GSK-3β)質(zhì)粒,建立tau蛋白過度磷酸化模型,實驗分為空白組、空白組+CIG(200μg/m L)、Wt GSK-3β、Wt GSK-3β+CIG(50μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(100μg/m L)、Wt GSK-3β+CIG(200μg/m L)。應用Western blotting方法檢測tau蛋白在多個位點的磷酸化水平,GSK-3β、p-GSK-3β-ser9以及細胞自噬通路中多個蛋白的表達水平。(3)第三部分:CIG對Src轉染N2a細胞的影響,(1)確定Src質(zhì)粒最佳轉染條件:將Src質(zhì)粒DNA(0.2,0.4,0.6,0.8μg)瞬時轉染入小鼠神經(jīng)瘤母細胞,觀察不同量Src對PP2A催化亞基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影響。(2)將0.6μg Src質(zhì)粒DNA轉染入N2a細胞,24h后加入CIG(50,100,200μg/m L)共同孵育24h,觀察CIG對Src,PTP1B,p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。結果:(1)第一部分:Morris水迷宮實驗顯示:模型組與假手術組相比,逃避潛伏期明顯增加,CIG灌胃給藥使模型組大鼠逃避潛伏期明顯降低;免疫熒光實驗:模型組神經(jīng)元樹突數(shù)量減少,明顯斷裂,且排列雜亂,給予CIG后,樹突斷裂顯著減少,排列逐漸恢復整齊;Western blotting實驗顯示:模型組與假手術組相比,tau蛋白在Thr217及PHF-1(識別Ser396/404位點)位點的磷酸化水平明顯增加,CIG使這些位點的磷酸化顯著降低;模型組皮層和海馬中p-GSK-3β-ser9表達降低,即GSK-3β激活,CIG灌胃給藥通過增加p-GSK-3β-ser9表達,抑制GSK-3β活性;模型組PI3K/AKT/GSK-3β信號通路活性被抑制,p-IGF-I R、p-PI3K、PI3K-110α、p-PDK1、p-AKT表達量均減少,即IGF-I R、PI3K、PDK1、AKT活性被抑制,同時模型組p-IRS1增加,IRS1活性被抑制,CIG灌胃給藥使IGF-I R、PI3K、IRS1、PDK1、AKT活性明顯增加,進而抑制GSK-3β活性;模型組中突觸相關蛋白p-synapsin、Synaptophysin、PSD95表達量明顯減少,CIG能升高p-synapsin、Synaptophysin、PSD95蛋白表達。(2)第二部分:N2a細胞過表達GSK-3β蛋白,p-GSK-3β-ser9、GSK-3β表達增加,tau蛋白在199/202、PHF-1位點磷酸化表達明顯增加;給予CIG處理后,p-GSK-3β-ser9明顯增加,即GSK-3β活性被抑制,GSK-3β總蛋白表達降低,tau蛋白在199/202、PHF-1位點磷酸化水平顯著降低。N2a細胞過表達GSK-3β后,給予CIG50、100、200μg/m L三個劑量,Beclin1、LC3Ⅱ、ATG12蛋白表達水平升高,即細胞自噬水平提高。(3)第三部分:(1)轉染Src(0.2,0.4,0.6μg)質(zhì)粒DNA到N2a細胞,Src蛋白表達明顯增加,p-PP2Ac水平上調(diào),PP2Ac蛋白總量表達無變化,tau蛋白在Ser199/202、Ser396位點磷酸化顯著增加;轉染0.8μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細胞與轉染0.6μg Src相比,p-PP2Ac表達下降,PP2Ac蛋白總量表達無變化,tau蛋白在Ser199/202、Ser396位點磷酸化降低。(2)轉染0.6μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細胞,Src蛋白表達增加,p-PP2Ac表達增加,tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Thr217以及Ser396位點的磷酸化水平明顯增加;CIG對Src蛋白表達無影響,能夠抑制p-PP2Ac的表達,抑制tau蛋白在Ser199/202、Thr205、Thr217以及Ser396位點的磷酸化。此外,CIG能上調(diào)PTP1B蛋白表達。結論:1 CIG能通過減少tau蛋白過度磷酸化,保護神經(jīng)元形態(tài),增加突觸功能,進而改善AD的學習記憶障礙;2 CIG能通過激活細胞自噬,降解GSK-3β蛋白;3 CIG能通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,抑制GSK-3β活性;4 CIG能通過增加PTP1B的表達,降低PP2A催化亞基C磷酸化,從而升高PP2A活性,進一步降低tau蛋白的過度磷酸化水平;5 CIG對Src蛋白無明顯調(diào)節(jié)作用。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;某些因素對大鼠胃肌電的影響[J];基礎醫(yī)學與臨床;2001年S1期

2 陳同度,張昌穎;素食大鼠的貧血現(xiàn)象[J];營養(yǎng)學報;1957年04期

3 陳偉強;趙善廣;;自制注射用大鼠固定裝置[J];上海實驗動物科學;1992年04期

4 肖柳英,林培英,馮昭明,張丹;不同周齡的SD大鼠生理、生化及體重的正常值測定[J];中藥新藥與臨床藥理;1996年03期

5 李淑云;簡易大鼠灌胃器的制作[J];錦州醫(yī)學院學報;2001年04期

6 楊明智,陳積圣;一種大鼠抓取與固定的新工具介紹[J];上海實驗動物科學;2001年03期

7 戴英,陸群;復方H_(505)對Wistar大鼠外周血的血液流變學指標的影響[J];中國血液流變學雜志;2001年01期

8 韋應波,孫喜慶,曹新生,姚永杰,馮岱雅,楊長斌;+Gz暴露時間對大鼠記憶功能和行為的影響[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2003年01期

9 呂學軍,郭俊生,李敏,周利梅,張永娟;暈船大鼠體內(nèi)鐵含量的變化[J];中國職業(yè)醫(yī)學;2003年04期

10 湯仁仙,王迎偉,王慧,周峰;201A中藥合劑對大鼠抗腎小球基底膜腎炎病變的影響[J];徐州醫(yī)學院學報;2003年06期

相關會議論文 前10條

1 尹音;孫振宇;胡敏;李冬霞;;持續(xù)性高正加速度對大鼠顳頜關節(jié)損傷的作用[A];第八屆全國顳下頜關節(jié)病學及（牙合）學大會論文匯編[C];2011年

2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：2632088