【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一種適應(yīng)性強、普遍存在的病原菌,能在各種極端惡劣的環(huán)境中存活,并在人和動物中引起廣泛的感染。由金黃色葡萄球菌引起的化膿性炎癥、肺炎和菌血癥是對公眾健康的嚴重威脅,尤其是在醫(yī)院手術(shù)期間。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年有超過1500萬人感染金黃色葡萄球菌。一旦被金黃色葡萄球菌感染,治療的主要方法就是使用抗生素。不幸的是,這種細菌已經(jīng)具備了抗藥性,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)已經(jīng)成為臨床治療中最困難的問題之一。目前,還沒有經(jīng)過批準(zhǔn)的針對金黃色葡萄球菌的疫苗,并且由于細菌的毒性因子比較復(fù)雜,導(dǎo)致細菌疫苗的設(shè)計也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此,迫切需要開發(fā)新的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌藥物。II型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV-2)是包膜雙鏈DNA病毒,是一種通過性傳播導(dǎo)致生殖器皰疹的主要原因,同時也是導(dǎo)致宮頸癌和人類免疫缺陷病的主要原因,反復(fù)發(fā)作,很難治愈。目前還沒有用于治療HSV-2感染的疫苗,而且常規(guī)使用的合成核苷類似物已經(jīng)導(dǎo)致了耐藥性的出現(xiàn)。因此,研發(fā)新的抗HSV-2的藥物是迫切需要的。近年來天然產(chǎn)物的應(yīng)用已經(jīng)成為一大熱點,主要原因為其分布廣泛、簡便易得、價格低廉等。中草藥作為具有抗菌、抗病毒療效的天然產(chǎn)物,在東亞地區(qū)已經(jīng)被使用了幾千年,而中草藥在治療病毒感染方面應(yīng)用也比較廣泛,且效果顯著,因此,天然產(chǎn)物是尋找抗菌、抗病毒藥物的豐富資源。巴天酸模(Rumex patientia L.,R.patientia L.),隸屬于雙子葉植物綱蓼目蓼科酸模屬,多年生草本植物,主要產(chǎn)自北溫帶。近年來,酸模屬植物因其抗腫瘤、抗菌、抗病毒等顯著的治療作用而引起人們的廣泛關(guān)注。截止到目前為止,關(guān)于酸模屬植物化學(xué)成分的研究報道很少,目前只分離到少數(shù)化合物,如:蒽醌、黃酮、萘和二苯乙烯。本研究中我們以巴天酸模根為研究對象,研究了其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用,以及對HSV-2病毒的抗病毒作用,并對其機理開展了初步研究。本論文研究主要包括以下幾個部分:(1)巴天酸�？咕翱共《净钚院Y選。確定巴天酸模提取物的最佳提取方式,即乙醇提取;篩選抑菌效果最好的菌株,即金黃色葡萄球菌;篩選抗病毒效果最好的毒株,即HSV-2病毒。通過液-液萃取法對巴天酸模醇提取物進行分離,成功獲得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取樣品。(2)巴天酸模提取物抑制金黃色葡萄球菌活性研究。測定巴天酸模醇提取物對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度(MIC)為10 mg/m L,并且體外殺菌效果顯著,正丁醇萃取樣品對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好,MIC值為2.5 mg/m L,體外殺菌效果顯著。初步探索了其抑菌機制,發(fā)現(xiàn)主要原因是巴天酸模提取物破壞了金黃色葡萄球菌的細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu),抑制了金黃色葡萄球菌的粘液分泌,抑制了Hla蛋白介導(dǎo)的溶血作用,促進了金黃色葡萄球菌細胞聚集,并且可能與金黃色葡萄球菌DNA溝槽結(jié)合,擾亂了金黃色葡萄球菌正常的生理機能功能,從而導(dǎo)致其死亡。(3)巴天酸模提取物抗HSV-2病毒活性研究。細胞水平上證明巴天酸模醇提取物對HSV-2病毒有較好的抗病毒活性,其主要方式為對HSV-2的直接滅活作用,通過構(gòu)建動物模型發(fā)現(xiàn),巴天酸模提取物可以顯著提高被攻毒動物的存活率,實驗黏膜組給藥存活率較PBS組提高28.57%,且臨床發(fā)病癥狀明顯好轉(zhuǎn)。同樣正丁醇萃取樣品抗HSV-2效果最好,0.25 mg/m L正丁醇萃取樣品對病毒的抑制率達95%,通過構(gòu)建攻毒動物模型發(fā)現(xiàn),2 mg/kg黏膜組給藥存活率較PBS組提高50%,且臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)。初步研究了其抗HSV-2病毒機制,發(fā)現(xiàn)巴天酸模提取物主要破壞了HSV-2病毒的核酸及VP5蛋白結(jié)構(gòu)。(4)巴天酸模提取物的毒性評價。通過MTT方法確定其細胞毒性,當(dāng)醇提取物濃度低于1.25 mg/m L時細胞毒性小于50%,0.5 mg/m L正丁醇萃取樣品對VERO細胞毒性較小,低于50%。通過急性毒理實驗證明醇提取物給藥濃度低于25 mg/kg時對小鼠正常生理活動沒有影響,為給藥安全濃度,低于50 mg/kg時為正丁醇萃取樣品給藥安全濃度。通過本論文的研究,發(fā)現(xiàn)巴天酸模提取物可作為一種抑菌和抗病毒藥物來源,為今后針對耐藥性細菌以及耐藥性病毒新藥研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
【圖文】：

（1）首先在細胞水平上研究了醇提取物對HSV-2 的作用階段，然后摸索HSV-2 攻毒劑量，進行動物保護性實驗。（2）選取不同有機溶劑萃取樣品通過MTT方法檢測細胞水平上抗HSV-2 效果，通過結(jié)果分析抗病毒活性成分主要位于在正丁醇萃取層，之后用正丁醇萃取樣品進行動物水平抗病毒實驗。（3）巴天酸模醇提取物初步抗病毒機理研究：通過核酸和蛋白電泳發(fā)現(xiàn)巴天酸模醇提取物對HSV-2 的核酸和VP5 蛋白具有破壞作用。4、巴天酸模提取物細胞毒性及動物毒性評價（1）細胞毒性評價：選取犬腎細胞（MDCK）、非洲綠猴腎細胞（VERO）、TZM-B1、人惡性胚胎橫紋肌瘤細胞（RD）四種細胞通過MTT實驗檢測巴天酸模醇提取物的細胞毒性。各有機層萃取樣品通過VERO細胞進行檢測。（2）動物毒性評價：分別用不同濃度醇提取物和正丁醇萃取樣品，連續(xù)腹腔給藥 7 天，觀察Balb/c小鼠存活率以及體重攝食變化等。

圖 2.1 巴天酸模水提取物流程圖提�。ɡ浣ǎ┤� 100 g巴天酸模植物根，加入 3 倍體積無水乙醇，，多功能攪拌機攪8h，超聲儀超聲破碎 30 min（功率 38%，on 5 s/off 5 s，冰�。�，6將得到的濾液 12000 rpm離心 30 min，上清 50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀物用DMSO溶解，過 0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存，流程圖如
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2631837