發(fā)布時間：2020-04-17 21:33

【摘要】：目的:改變雷公藤多苷化學組分含量,獲得對腎病綜合征有持效減毒作用的雷公藤新多苷,對其進行體內外毒性評價、制備工藝優(yōu)化以及主要成分物質基礎研究,為雷公藤新多苷的臨床應用提供依據(jù)。方法:據(jù)前期課題組研究,經(jīng)過化學組分含量改變的雷公藤新多苷對腎病綜合征有持效作用。主要是雷公藤多苷含有的WLL03有類似雷公藤內酯醇的功效。本實驗將對雷公藤新多苷的毒性及以活性為導向的物質基礎進行以下研究:1.WLL03的制備采用炮制的方法,將雷公藤內酯醇在磷酸緩沖溶液中水解生成WLL03。再經(jīng)制備液相色譜法純化獲得。2.雷公藤新多苷的制備采用炮制的方法,對雷公藤多苷進行整體炮制,將雷公藤多苷中的雷公藤內酯醇轉化為WLL03,并再補加一定比例的WLL03,組成若干組雷公藤新多苷,并測定各組雷公藤新多苷中雷公藤內酯醇及WLL03的含量。3.雷公藤新多苷細胞毒性實驗通過MTT法、CCK8比色法測定多種細胞24 h、48 h的存活率,研究WLL03、雷公藤內酯醇及各組雷公藤新多苷的毒性效應。4.雷公藤新多苷動物急毒實驗采用小鼠急性毒性實驗方法(LD50實驗),一天內給小鼠較大劑量藥物(雷公藤多苷、雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ),觀察小鼠急性癥狀,記錄體重變化及累積死亡數(shù)。為雷公藤的實驗研究及臨床安全使用提供實驗依據(jù)5.WLL03的初步藥代動力學實驗采用LC-MS/MS法,在選擇性離子對監(jiān)測(MRM)下,檢測WLL03在SD大鼠的藥代動力學參數(shù)及生物利用度的評價。結果:1.雷公藤內酯醇經(jīng)化學炮制獲得WLL03,其分離提取率約為20%。2.在課題組前期基礎上,獲得雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ。雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ、V中雷公藤內酯醇的含量分別為:232.34±2.01μg/g、439.97±2.24μg/g、232.82± 1.93 μg/g,WLL03的含量分別為:2380.29 μg/g、2322.13 μg/g、20589.03 μg/g。WLL03細胞毒性極小,24h的IC50值分別為:HK-2(21919.73±1024.03 ug/mL)、HL-7702(9427.67 ±334.77 ug/mL)、GC-1(303862.92 ±9502.51 ug/mL)、GC-2(76578.35 ±1627.39 ug/mL)、TM4(5562.77 ± 194.13 ug/mL)、足細胞(142.72±5.32 ug/mL),48 h的IC50值分別為:HK-2(10581.12±906.26 ug/mL)、HL-7702(1561.46±99.24 ug/mL)、GC-1(353.79± 16.60 ug/mL)、GC-2(4300.40±264.90 ug/mL)、TM4(4224.97± 133.39 ug/mL)、足細胞(220.06±0.13 ug/mL)。各組藥物對細胞的毒性效應總體趨勢由小到大依次為:WLL03、雷公藤新多苷V、雷公藤新多苷Ⅱ、雷公藤新多苷Ⅳ、雷公藤多苷、雷公藤內酯醇。3.雷公藤多苷的小鼠半數(shù)致死量LD50為571.52 mg/kg,95%可信限為(486.78-682.51 mg/kg)雷公藤新多苷Ⅱ的最大劑量為2400 mg/kg,死亡率為1.67%,相當于人日用最大量的1600倍,雷公藤新多苷V的最大劑量為620 mg/kg,相當于人日用量的413.33倍,死亡率為16.67%。4.WLL03的離子對為377.2→217.1,在0.975ng/mL-1000ng/mL內,線性關系良好(r=0.9939),提取回收率大于89%。WLL03和內標有較大質譜峰和較好的分離度,空白血漿檢測時有干擾,經(jīng)多方原因排除,猜測其干擾主要來于提取過程受到污染,同時發(fā)現(xiàn)大鼠飼料有377分子離子。結論:經(jīng)前期實驗表明,湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的雷公藤多苷可作為本實驗藥物來源,經(jīng)過炮制后補加定量WLL03,獲得雷公藤新多苷Ⅱ、雷公藤新多苷Ⅳ、雷公藤新多苷Ⅴ。細胞實驗表明,WLL03毒性小或無毒性,結合動物毒性實驗表明,經(jīng)過炮制改變雷公藤多苷組內含量獲得雷公藤新多苷Ⅱ,其毒性比雷公藤多苷、雷公藤新多苷Ⅳ更小,并且具有統(tǒng)計學意義。
【圖文】：

逑２．邋３．邋１邋ＷＬＬ０３邋的制備逡逑將制備溶液在“２．邋２．邋１．邋３”項的條件下制備，ＷＬＬ０３洗脫液的收集范圍如圖２，紅逡逑線到綠線之間。雜質洗脫液收集范圍從１６邋ｍｉｎ－２０ｍｉｎ，其余時間段導入廢液瓶。將收逡逑集的ＷＬＬ０３洗脫液于旋轉蒸發(fā)儀上揮千溶劑，加少量甲醇溶解，小心轉移至ＥＰ管中，逡逑以氮氣吹干儀常溫下吹干樣品，，精密稱重。逡逑ＤＡＤｌＡ．＆ｇ＝：１９．：邋Ｒｓｆ＝ｏｆｆ３Ｄ．ＶＷＬＬ－￡ＪＧＴ＼ＤＡＴＡ＼ＺＢ－ＬＧＴＳＣ－２０１６－０６－二４＊邋２Ｓ－１５＼ＣＣ：：－Ｃａ２．Ｄ；ｉ逡逑ｉ逡逑１邋１逡逑１２００逡逑１０００邋丨邐Ｉ逡逑？邐ｉ逡逑６００邐ＷＬＬ０３邋收集區(qū)域邐ｉｆ逡逑４０0邋ｌ邐＾邐邐雜質收集區(qū)域逡逑２００邐＿邐＼邋｜邐？邐＼邋務丨逡逑°邐５邐１０邐１５邐２０邐＇邐２５逡逑圖２邋ＷＬＬ０３洗脫液自動收集的圖譜逡逑２．邋３．邋２邋ＷＬＬ０３的純度檢g義先≈票傅模祝蹋蹋埃呈柿�，监]柿考狀既芙�，高速离心过０．邋２２邋７w礪四�，进行ＵＰＬ＞捔x洗慷燃觳忮義仙字海攏牛儒澹櫻瑁椋澹歟溴澹遙校保稿澹ǎ玻保兀保埃板危保罰ǎ椋恚渙鞫啵閡譯媯逑擔惶蒎義隙認賜�，腺n殉絳蚣恚常渙魎伲海埃沖澹恚蹋恚椋�；检测波长：２１９．２邋ｎｎｉ；柱螖n海常

本文編號：2631320